| 實驗步驟 |
階段 1: 文庫的構建
材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。
ATP(10 mmol/L)
酚：氯仿（1:1,V/V)
TE(pH8.0)
酶及緩沖液
PvuⅡ
限制性內切核酸酶
pSPL3 多克隆位點圖譜見圖 11-16
T4DNA 連接酶
凝膠
瓊脂糖凝膠（0.9%m/V), 用 TAE 配制
見步驟 3
瓊脂糖凝膠，預制
見步驟 1
核酸與寡核苷酸
黏粒載體、大腸桿菌人工染色體或酵母人工染色體 DNA, 含有靶標基因組 DNA 區域。
用于分析的重組子 DNA 純化方法見第 4 章。
或基因組 DNA
按第 6 章提供的方法之一制備
培養基
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板
參見步驟 8 決定平板的合適規格。
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 肉湯培養基
SOC 培養基
專用設備
預設溫度為 15°C 和 65°C 的水浴
附加試劑
本方案步驟 8 需要的試劑列在第 1 章，方案 20。
本方案步驟 6 需要的轉化所需試劑列在第 1 章，方案 23、24 或 25。
本方案步驟 10 和 12 需要的試劑列在第 1 章，方案 1 或 9。
載體與菌株
大腸桿菌菌株 HB101, 處于轉化感受態
按第 1 章，方案 23,24 或 25 制備。
質粒 pSPL3
Life Technologies 公司提供單獨的或作為試劑盒組分的質粒 pSPL3。
方法
1. 對 pSPL3 進行限制酶切以插入基因組 DNA(pSPL3 多克隆位點圖譜見圖 11-16)。對線性化的質粒 DNA 去磷酸化處理，電泳并從凝膠中回收純化質粒。
質粒 DNA 酶切完全非常重要，產物應為大小約 6kb 的單一片段。
2. 用與上一步相同的限制酶消化 1~2ug 的基因組 DNA 或含有目的基因組 DNA 的重組質粒。
3. 用 0.9% 的瓊脂糖凝膠電泳（TAE 體系）分析 10% 的基因組酶切產物。
基因組 DNA 須酶切完全而無降解。凝膠電泳分析時，注意觀察有無污染細菌（或酵母）基因組 DNA, 污染的 DNA 通常呈彌傲的背景條帶。
4. 將基因組 DNA 酶切體系置 65°C15 min 終止酶切反應，酚: 氯仿抽提并用標準的乙醇沉淀法回收 DNA。產物溶于 TE(pH8.0), 濃度為 100ug/ml。
5. 混合以下組分將基因組 DNA 連接到載體上：
酶切后的基因組 DNA 150ng
酶切并經去磷酸化的 PSPL3 50ng
10x 連接反應緩沖液 1ul
T4 噬菌體 DNA 連接酶 10Weiss 單位
加 H2O 至 10ul
室溫溫育 2~3 h 或 15°C 過夜。
10X 連接反應緩沖液組分已添加 ATP, 則反應混合物中可加入更大體積的載體或外源 DNA。使用商品化的含 ATP 的連接續沖液，則無須添加 ATP。確保引入只有載體 DNA 的對照，這對于評價構建的文庫的質量非常重要。
6. 用連接反應產物轉化 40ul 的 HB101 感受態細胞。
確保用陽性對照（載體 DNA) 和陰性對照（無 DNA 體系）同時轉化以評價轉化效率。
重要：由于在其他菌株中 pSPL3 復制不穩定，使用 HB101 作為文庫和載體擴增的宿主是必須的（Churchand Buckler1999)。
7. 轉化后菌液中加入 800ul 的 SOC 培養基，37°C 培養 30~45 min 使質粒編碼的抗生素抗性標記基因表達。
8. 在氨芐青霉素存在下 37°C 搖菌過夜以擴增文庫。
如使用單個黏粒：將 100ul 轉化混合物涂布一個含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板。剩余的加入含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 肉湯液體培養基 2 ml 繼續培養。
取小量轉化物在 LB 平板上培養可評價轉化效率。
如使用 BAC、PAC 或黏粒庫：將所有轉化混合物涂布在多個 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板（150 mm) 上。
這樣處理是為了消除因營養競爭而導致的某些克隆的優勢生長，使構建的文庫更具代表性。
9. 通過比較重組子與非重組子數目估計連接效率（也就是與只有 pSPL3 的連接混合物轉化 HB101 所得克隆數進行比較)。
重組子至少應達到非重組子的 500 倍到 1000 倍。
10. 如在 150 mm 平板上進行文庫擴增，直接進入步驟 11。對于在液體肉湯培養基中擴增的基因組文庫，用標準的堿變性法（見第 1 章，方案 1) 或質粒提取試劑盒純化質粒，然后進入步驟 13。
11. 如整個庫鋪在大的 LB 瓊脂平板上，則加入 10 ml 肉湯培養基浸沒平板，并小心從瓊脂表面將菌落刮下來，盡量減少刮入肉湯中的瓊脂量。
12.
用經過修改的標準堿變性法小量質粒提取程序純化步驟 11 中獲得樣品中的質粒，依次加入細菌沉淀中的試劑量調整為堿裂解液Ⅰ(300ul),
裂解液Ⅱ(600ul) 及裂解液Ⅲ(450ul)。為簡化程序，在加入堿裂解液 I 后，將細菌懸液移入一個 2 ml
離心管中，這樣其余程序可在此離心管中完成。在加入溶裂解液Ⅲ并離心后，將粗制的質粒上淸分為兩份置于兩個 1.5 ml
離心管中。用酚：氯仿及氯仿對上清進行抽提，獲得的上清用異戊醇沉淀，最后合并兩管中的 DNA 重懸液。也可用商品化的質粒提取試劑食完成此步（第 1
章，方案 9)。
13. 取部分純化后的質粒 DNA 用 PvuⅡ進行酶切，通過電泳觀察構建的文庫質量。
PvuⅡ酶切位點靠近質粒的多克隆位點。空載體酶切產物電泳顯示
4kb 和 2kb 的條帶。童組克隆經切割仍可見明顯的 4kb 條帶，但 2kb 的條帶則應很微弱或沒有。2kb
條帶如很明顯則提示文庫的質量不佳，或者 (但可能性較小）基因組 DNA 經 PvuⅡ切割成大多為 2kb 的片段（圖
11-17)。如文庫的質量令人滿童，則可用于實驗的下一步驟。
階段 2: 電穿孔法將文庫轉染 COS-7 細胞
材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。
無二價陽離子的磷酸緩沖液（PBS）
酶及緩沖液
胰酶-EDTA 溶液
核酸與寡核苷酸
DNA
用于轉染的質粒 DNA 制備見本方案階段 1, 步驟 10~12。
用作對照的質粒載體（步驟 3)
培養基
含 10% 熱滅活胎牛血清的 Dulbecco's modified Eagle's 培養基（DMEM)
離心轉頭
Sorvall H1000B 轉頭或等同規格轉頭
專用設備
電穿孔轉染設備以及 0.4 cm 寬的電轉染槽
組織培養平皿（100 mm)
寬口加樣器頭
細胞與組織
COS-7 細胞
細胞須在含 10% 熱滅活胎牛血清的 DMEM 培養至 75%—85% 致密。關于細胞的處理細節，包括胰酶消化，見 Spector 等（1998b)。
方法
1. 用無二價陽離子的 PBS 洗滌單層 C0S-7 細胞。通過胰酶-EDTA 處理將細胞從平皿表面消化下來。4°C、250 g(Sorvall H1000B 轉頭上相當于 1100r/min) 離心 10 min 回收細胞。
重要：在整個過程中須保持 COS-7 細胞處于預冷狀態。
關于細胞胰酶消化細節見 Spector 等（1998b)
2. 將用于轉染的 DNA 樣品溶于無二價陽離子的 PBS 并調整至 100ul。
轉染所需的 DNA 量應按第 16 章，方案 5 進行優化，
3. 用 700ul 無二價陽離子的 PBS 重懸 4X106COS-7 細胞。在預冷的電轉染槽中混合細胞與 DNA(槽內寬 0.4 cm)。將混合物放置冰上 10 min。
PBS 體系中如含二價陽離子，將導致電轉染時產生電弧，可破壞電穿孔僅。
確保應用空載體 DNA 進行電轉化，作為實驗對照。
4. 小心重懸細胞，按 1.2kV(3kV/cm) 和 25uF 進行電穿孔轉染實驗。迅速將電轉槽重置于冰上，并放置 10 min。
電穿孔轉染條件按第 16 章，方案 5 描述的方法進行優化。
5. 用寬口加樣器頭將 1x106 的電轉染后的細咆轉入 100 mm 的組織培養平皿中，每個平皿已加入 10 ml 預熱至 37°C 的含 10% 熱滅活胎牛血清的 DMEM 培養基。在設定 37°C、5%~7%CO2 及一定濕度的培養箱中培養 48~72 h。
階段 3:mRNA 的提取
材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。
DEPC 處理水
乙醇
NaCl(5mol/L)
酚
酚：氯仿
無二價陽離子的磷酸緩沖液（PBS)
SDS(5%m/V)
TMK 緩沖液
10 mmol/LTris-HCl(pH7.5)
10 mmol/LKCl
1 mmol/LMgCl2
Triton X-100(10%V/V) 或 Nonidet P-40(4%，V/V)
離心轉頭
Sorvall H1000B 轉頭或等同規格轉頭
專用設備
細胞刮子或橡膠刮
聚苯乙烯離心管（15 ml), 冰上預冷至 0°C
細胞與組織
分別經重組 pSPL3 和非重組 pSPL3 轉染的 COS-7 細胞
方法
1. 用冰預冷的不含鈣、鎂離子的 PBS 洗滌平皿中的轉染 COS-7 細胞三次。洗滌過程中將平皿保持在冰上。
2. 每個平皿中加入 10 ml 預冷的 PBS。保持平皿在冰上，小心的將細胞刮除下來。
3. 將細胞懸液轉入預冷的 15 ml 聚苯乙烯離心管中。
使用透明的聚苯乙烯離心管，有利于步驟 8、9 中不含細胞核的胞漿的回收。
4.4°C、300 g（Sorvall H1000B 轉頭上相當于 1200r/min) 離心 8 min 回收細胞。
5. 盡可能傾去上清，并用加樣器除去殘存的上清。
6. 在 300ulTFK 緩沖液中重懸 1X106 至 2x106 的 COS 細胞，冰上放置 5 min。
7. 加入 15ul 的 10% 的 Triton X-100 或 4% 的 Nonidet P-40, 冰上放置 5 min。
加入非離子去污劑可導致質膜的輕微破解而核膜保持完整。
8.4°C、500 g(Sorvall H1000B 轉頭上相當于 1500r/min) 離心 5 min 沉淀細胞核。
9. 將上清移入預冷的 1.5 ml 小離心管中。
重要：移取上淸時應異常小心，切不可觸及細胞核沉淀。如核膜破裂會導致基因組 DNA 污染，樣品將非常黏期而難以吸取。
10. 加入 20ul 的 5%SDS 和 300ul 的酚，劇烈振蕩后最大速度離心 5 min，樣品將分為有機相和水相。
11. 將水相移入含 300ul 酚: 氯仿的 1.5 ml 小離心管中，劇烈振蕩后室溫最大速度離心 3 min 進行分相。
12. 移取上層的水相至預冷的 1.5 ml 小離心管中，加入 120 的 5mol/LNaCl 和 750ul 的乙醇。-20°C 放置 2~3 h 或-80°C 放置 30 min 以沉淀 RNA。
核酸在乙醇中比在水中更穩定。如長期保存，RNA 應置于乙醇中-80°C 凍存（見第 7 章，方案 1 結尾部分的專欄“RNA 的保存"）。
13.4°C、最大速度離心 10 min 回收 RNA。
14. 棄上清并用 70% 乙醇洗滌沉淀。空氣干燥后，將沉淀重懸于 20 g 的 DEPC 處理水中。
階段 4: 反轉錄 PCR
材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液
10x 擴增緩沖液
氯仿
DEPC 處理水
DTT(lmol/L)
dNTP 溶液，每種核苷酸濃度為 1.25 mmol/L
酚
RNase 抑制劑
酶及緩沖液
Bst XI
EcoR V
Mo-MLV 反轉錄酶
Taq DNA 聚合酶
DNA 尿嘧啶糖基酶（1 單位/ul)
凝膠
瓊脂糖凝膠（1.5%m/V), 用 TBE 配制
核酸與寡核苷酸
寡核苷酸引物 [20 mmol/L,TE(pH8.0) 配制]
分別提取自轉染有對照載體和重組載體的 COS-7 細胞的 RNA(階段 3)。
培養基
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板
專用設備
自動微量加樣器所用的加樣器尖頭
微量離心管（PCR 擴增用 0.5 ml 薄壁離心管，無 RNase）
帶退尖頭裝置的自動加樣器
可設置方案中反應程序的熱循環儀
如熱循環儀無熱蓋. 使用礦物油或封口石蠟防止 PCR 反應混合物的蒸發。封□石蠟不僅可防止蒸發，還可起到在反應混合物加熱之前使反應組分（如引物與模板）暫時隔銫的效果。這可防止在反應的起始階段由于引物非特異的結合模板引發的擴增。
預設溫至 42°C、55°C 和 65°C 的水浴
附加試劑
本方案步驟 14 需要的試劑列在第 1 章，方案 25。
載體與菌株
大腸桿菌 DH5α(或其他可產生α互補的菌株）
載體 pBluescriptⅡ(KS 或 SK)(Stratagene 公司）
方法
cDNA 的合成
1. 以 SA2 寡核苷酸作為引物，用步驟 3 中獲得的胞漿 RNA 作模板制備 cDNA 第一鏈。
在 1 個無 RNase 的 0.5 ml 離心管中混合以下試劑:
RNA 3ul
10x 壙增緩沖液 2.5ul
dNTP 溶液 (每種 1.25 mmol/L) 4ul
0.1mol/LDTT 1ul
3'引物（SA2,20umol/L) 1.25ul
DEPC 處理水 11.25ul
將反應混合物 65°C 放置 5 min。
重要：為降低 RNA 中二級結構的形成，不要將反應混合物放置于冰上。
然后加入：
RNase 抑制劑 1ul
Mo-MLV 反轉錄酶（200 單位） 1ul
42°C 溫育 90 min。
2. 同時使用寡核苷酸引物 SA2 和 SD6 進行 cDNA 第二鏈的有限合成。在一個無菌的薄壁離心管中混合以下試劑：
反轉錄反應混合物（來自步驟 1) 12.5ul
1x 擴增緩沖液 4ul
dNTP 溶液（每種 1.25 mmol/L) 6ul
引物 SA2(20umol/L) 2ul
引物 SD6(20umol/L) 2.5ul
Taq DNA 聚合酶 1~2 單位
加 DEPC 處理水至 40ul
同樣處理只含載體的對照，作為一個重要的 PCR 分析對照。
3. 如熱循環儀無熱蓋，反應混合物上方加入 1 滴（約 50ul) 的輕比重礦物油。或者按熱啟動 PCR 方式加入封口石蠟。將反應管放入熱循環儀。
4. 按下表列出的變性、復性和延伸時間和溫度進行擴增反應。
用于克隆的 cDNA 與載體的制備
5.PCR 反應產物中加入 30 單位的 BstXI, 并加入 1 滴低比重礦物油（如果在前面步驟中未加的話)。將混合后的反應管置 55°C 溫浴過夜。
BstXI
酶切將大大減少空載體剪接產物以及由于載體內含子含隱蔽剪接位點而產生的假陽性。載體質粒 pSPL3
含有多個隱蔽剪接位點。由這些位點引發的異常剪接產物一般只占擴增產物中很小一部分，而且通常也只出現在空載體反應管、pSPL3
上構建的文庫質量很差或者基因組 DNA 中不含通過這種方法可鑒定出的轉錄物。
6. 反應管中再加入 20 單位的 BstXI 并置 55BstXI 溫浴 2~3 h。
7. 在進行上述步驟的同時，用 EcoR V 徹底酶切 1ug 的質粒載體 pBSⅡ(KS 或 SK)。
酚抽提并用乙醇沉淀以純化酶切產物中的 DNA, 純化產物用水稀釋至 2ng/ul。
8. 在一個 0.5 mlPCR 擴增管中混合以下試劑：
經 BstXI 酶切后的反轉錄 PCR 產物（步驟 6) 5-10ul
10X 擴增緩沖液 4.5ul
dNTP(毎種 1.25 mmol/L) 7.5ul
引物 SADU(20umol/L) 2.5ul
引物 SDDU(20umol/L) 2.5ul
Taq DNA 聚合酶 10~20 單位
加 H20 至 45ul
9. 在另一個 0.5 mlPCR 擴增管中混合以下試劑：
EcoRV 酶切的 pBSⅡ(KS 或 SK）（2ng/ul) 10ul
10x 擴增緩沖液 10ul
dNTP(毎種 1.25 mmol/L) 16ul
引物 BSD-U(20umol/L) 5ul
引物 BSA-U(20umol/L) 5ul
Taq DNA 聚合酶單位 2~4 單位
加 H2O 至 100ul
10. 如熱循環儀無熱蓋，在反應混合物（步驟 8 和 9) 中加入 1 滴（約 50ul) 的輕比重礦物油。或者按熱啟動 PCR 方式加入封口石蠟顆粒。將反應管放入熱循環儀。
11. 按下表列出的變性、復性和延伸參數進行擴增反應。
12.1.5% 瓊脂糖凝膠（TBE 配制） 電泳分析小量 PCR 產物以評價反應質量。反應產物應為典型的彌散條帶（圖 11-19)。
外顯子捕獲產物的克隆
13. 在一個 0.5 ml 的小離心管中加入下列試劑：
BstXI 酶切的 cDNA(步驟 8) 經
步驟 11 擴增反應后產物 3ul
EcoRV 酶切的 pBSⅡDNA(步驟 9) 經
步驟 11 擴增反應后產物 1ul
10x 擴增緩沖液 1ul
DNA 尿嘧啶糖基酶（UDG,1 單位/ul) 1ul
加 H2O 至 10ul
混合后置 37°C 溫育 30 min。
重要：此反應中，含
dU 殘基的 DNA 將被 DNA 尿嘧啶糖基酶降解，另外，帶有互補末端的酶切質粒與擴増的 cDNA 將形成重組子為防止載體與 PCR
產物的非特異結合，37°C 溫育后不要將反應管置于冰上。如不能立即進行步驟 14 和 15, 則將反應管繼續置于 37°C 或-20°C
凍存備用。
14.CaCl2 法將全部 UDG 反應混合物轉化 30~50ul DH5α菌液。
15. 取 100~500ul 的轉化菌液涂布含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 瓊脂平板，37°C 培養過夜。
階段 5: 克隆分析
材料
緩沖液與溶液
按合適比例稀釋貯存液。
10x 擴增緩沖液
酶及緩沖液
TaqDNA 聚合酶
凝膠
瓊脂糖凝膠（1.5% m/V),TAE 配制
見歩驟 7。
核酸與寡核苷酸
dNTP 溶液，四種核苷酸的濃度均為 1.25 mmol/L
克隆入載體 pBSⅡ中的外顯子捕獲產物
以重組 DH5a 克隆形式制備（見階段 4)。
寡核苷酸引物 [濃度 20 mmol/L 溶于 TE(pH8.0)]
培養基
含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 肉湯培養基
含 30% 甘油 (v/v) 的 LB 肉湯培養基
專用設備
PCR 用 96 孔微量滴定板
多通道加樣器或加樣裝置（例如 Dank or Scientific 公司產品）
可放入 96 孔微滴定板的熱循環儀
附加試劑
本方案歩驟 8 需要的試劑列在第 12 章，方案 3、4 或 5。
方法
1. 在 96 孔微量滴定板每孔中加入 100ul 含 50ug/ml 氨芐青霉素的 LB 肉湯培養基，并向每個孔中接入一個獨立生長的轉化菌克隆（來自第 4 階段步驟 15)。用 Parafilm 封住平板，37°C 生長 3~4 h, 不需要搖動滴定板。
2. 混合下列組分制備可進行 100 個 PCR 反應的混合物：
10X 擴增緩沖液 250ul
dNTP 溶液（毎種 1.25 mmol/L) 400ul
-20 寡核苷酸引物（20 mmol/L) 125ul
REV 寡核苷酸引物（20 mmol/L) 125ul
H2O 1475ul
Taq DNA 聚合酶 75 單位
在個新的 96 孔 PCR 反應板每孔中加入 24ul 上述混合物。
3. 用 96 孔微量點樣復制裝置將步驟 1 滴定板中的菌液移到含反應混合物的 96 孔 PCR 反應板中。
4, 如使用的熱循環儀不帶熱蓋，在每孔反應液中加入 1 滴（約 50ul) 礦物油。也可采用類似熱啟動的方法，每孔中加入 1 粒固體石蠟。將 96 孔 PCR 反應板置于熱循環儀中。
5. 按下表中的變性、復性及延伸時間和溫度進行 PCR 擴增
6. 用多孔加樣器將步驟 1 制備的菌液復制到另 1 塊滴定板上，37°C 搖菌過夜，每孔中加入 100ul 含 30% 甘油的 LB 肉湯培養基，Parafilm 膜封口后-80°C 凍存。
7. 在 1.5% 瓊脂糖凝膠上電泳分析步驟 5 中每孔的擴增產物。
電泳顯示的擴增條帶應大小不一, 根據大小是無法判斷 ETP 的豐余性 (redundancy), 這是由于 PCR 產物大小集中于 120bp。
8. 確定每個 ETP 的序列（見第 12 章方案 3、4 或 5)。
克隆時使用的載體若為 PBSⅡSK-用 T7 引物測序結果為 ETP5'端起始序列。測出 ETP 序列兩側的 pSPU 序列如下：
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