外源DNA片段在質粒載體中的克隆實驗

限制性內切酶可識別特定位點并切割DNA產生粘性末端或平端的外源片段，經DNA的純化處理后用于連接反應；選擇克隆載體pUC18多克隆位點上相應的限制性內切酶切割，并用堿性磷酸酶處理防止載體自連；在連接酶的作用下將外源片段連接到載體上，實現外源片段的克隆。

DNA片段 PUC18

R.E buffer 水 凝膠 氯仿 異戊醇 乙醇

離心機

1.  載體pUC18和外源DNA片段的限制性酶切：
   50 μl反應體系，用1.5ml tube，冰上操作）
   DNA           30 ul
   R.E           1 ul
   10xbuffer        5 ul
   

   ddH2O           14 ul
   

   
   外源片段酶切產物和5 ul 37 ℃反應1hr，分別取8 ul PUC18酶切產物于1.0%凝膠檢測酶切是否完全；按2－5步純化、回收DNA
   
   2.  加入ddH2O 150  （擴大體積），加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻，12000 g離心10 min；
   
   3.  吸取上清，加1/10體積3 M NaAc和兩倍體積無水乙醇，-20 ℃放置15分鐘以上；
   
   4.  12000 g 4 ℃冷凍離心15分鐘；
   
   5.  ddH2O（1.5 ml ddH2O（0.5 ml tube中），PUC18溶于20 ul 倒去上清，用75％乙醇浸洗沉淀，風干后外源DNA溶于10  tube中）；
   
   6.  按以下反應去除載體PUC18的5'磷酸基團，50 ℃反應30 min 以上
   DNA                   20 ul
   

   CIAP（TaKaRa）        0.5 ul
   

   buffer              4.0 ′10 μl

   ddH2O               15.5 ul
   

   
   7.  70 ℃水浴10 min, 使CIAP失活；
   
   8.  按2－5步純化載體，溶于10 ul ddH2O；
   
   9.  連接反應
   DNA                10 ul
   pUC18            2.5 ul
   buffer           1.5 ′ 5 ul
   mT4 ligase   3 U/ul
   
   16 ℃水浴過夜
   
   10.  轉化大腸桿菌感受態細胞
   
   11.  轉化子的鑒定

   
   

1. DNA重組技術包括載體及外源DNA片段的酶切消化、目的片段的獲得及純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內容。

2. 氯仿對眼睛、皮膚、粘膜及呼吸道都有刺激作用，它是致癌劑并可損傷肝臟和腎臟，操作時需戴手套、安全鏡并在通風櫥中進行。苯酚是強腐蝕劑，能引起嚴重燒傷。操作時應戴手套、安全鏡、穿防護服，并在通風櫥中進行。

1. 克隆中所用到的幾種酶：（1）限制性內切酶（2）堿性磷酸酶（3）連接酶（體外催化磷酸二酯鍵的形成可使用兩種酶：大腸桿菌連接酶和T4噬菌體連接酶），但幾乎在所有的克隆中T4噬菌體連接酶都是首選的酶，因其能在正常的反應條件下能有效的將平端連接起來。

2. 載體的負載能力：即能克隆多大的DNA片段，是否有合適的限制性內切酶位點，酶切位點的性質，粘性或平末端，是否有選擇重組克隆的其它標記，如藍白斑篩選等。