多聚酶鏈式反應技術（PCR技術）(1)

多聚酶鏈式反應即PCR（polymerase chain reaction）技術，應用這一技術可以將微量目的基因（DNA片段）擴增一百萬倍以上。PCR反應理論的提出和技術的完善對于分子生物學的發展具有特殊的意義，它以敏感度高、特異性強、產率高、重復性好以及快速簡便等優點迅速成為分子生物學研究中應用最為廣泛的方法之一，并使得很多以往無法解決的分子生物學研究難題得以解決。發明這一技術的K. Mullis因此貢獻而獲得了1993年度諾貝爾化學獎。

一、PCR技術的工作原理

PCR的基本工作原理是以擬擴增的DNA分子為模板，以一對分別與模板5'末端和3'末端互補的寡核苷酸片段為引物（primer），在耐熱DNA聚合酶的作用下，按照半保留復制的機制沿著模板鏈延伸直至完成新的DNA分子合成。重復這一過程，即可使目的DNA片段得以大量擴增（圖14-1）。

組成PCR反應體系的基本成分包括：模板DNA、特異性引物、耐熱DNA聚合酶（如Taq DNA聚合酶）、dNTP以及含Mg2＋的緩沖液。

PCR的基本反應步驟包括：（1）變性：將反應體系加熱至95℃，使模板DNA完全變性成為單鏈，同時引物自身以及引物之間存在的局部雙鏈也得以打開；（2）退火：將溫度下降至適宜溫度使引物與模板DNA退火結合；（3）延伸：將溫度升至72℃，耐熱DNA聚合酶發揮酶活性，以dNTP為底物催化DNA的合成反應。上述三個步驟構成一個循環，新合成的DNA分子繼續作為下一輪合成的模板，經多次循環（25～30次）后即可達到擴增DNA片段的目的。

二、PCR引物的設計

PCR反應成功的一個關鍵條件是正確設計引物。好的引物設計可以避免非特異產物的產生，也極大地影響著擴增產量。當然，有了好的引物，依然需要進行反應條件的優化。然而如果不遵守引物設計的基本規則，即使改變反應條件也不會有什么好效果。

引物設計需要在擴增特異性和擴增效率兩方面目標上取得平衡。目前，可利用計算機軟件方便地進行引物設計，引物設計軟件會通過每一引物設計變化的預定值在兩個目標間取得平衡，找出最佳引物。不過，我們也須根據實驗具體要求進行適當調整（如在醫學診斷中，可以以犧牲效率為代價調整引物以提高特異性，因為在臨床診斷中避免假陽性比產生大量擴增產物更重要）。以下是引物設計的幾項基本原則。

1. 引物長度　在16～40 bp范圍內，以18～24 bp最佳。引物過短，會降低產物的特異性，每增加一個核苷酸，引物特異性可以提高4倍。注意，這里引物的長度是指與模板DNA序列互補的部分，并不包括為后續克隆而加的酶切位點等額外序列。引物過長，會使退火過程不完全，與模板結合不充分，以至引起擴增產物的明顯減少。

2. 引物末端　引物的3'末端對PCR反應是非常關鍵的。由于引物3'端的第一和第二個堿基影響Taq DNA聚合酶的延伸效率，因而會影響PCR反應的擴增效率及特異性。引物的最好選T、G、C而不選A；同時，引物的3'端應該為保守氨基酸序列，即采用簡并密碼少的氨基酸如Met、Trp，且要避免密碼子第三個堿基的擺動位置位于引物的3'端。

對于引物5'末端的堿基并無嚴格限制。當引物長度足夠時，引物5'端的堿基可不與模板DNA互補結合而呈游離狀態。因此可在引物5'端加限制性內切酶位點、啟動子或其他序列等，以便于PCR產物的分析、克隆。引物5'端最多可加到10個堿基而對PCR反應無影響。

一對引物之間可能存在互補序列，特別是3'末端應盡量避免互補，以免形成“引物二聚體”造成引物浪費和非特異擴增。每一個引物的內部也應盡量避免形成二級結構，特別是引物的末端應無回文結構。

3. 引物G＋C含量和Tm值　引物G＋C含量應該保持在40%～75%之間。G＋C含量50%的20個堿基寡核苷酸鏈的Tm值約在56℃～62℃范圍內。在此范圍內，既可以保證有效退火，又維持了良好的特異性。一般引物設計軟件在核苷酸序列確定后即可算出引物的Tm值、檢查有無引物二聚體以及回文結構等。

4. 引物的位置　引物的序列應位于基因組DNA中的保守區，且與非擴增區無同源序列，這樣可以減少引物與基因組的非特異結合，提高反應特異性。若是以cDNA為模板，則首先應盡力使引物和產物保持在mRNA的編碼區域內。其次，盡量把引物放到不同的外顯子上，以便使特異PCR產物與從污染DNA中產生的產物在大小上相區別。

三、PCR的基本操作步驟及條件優化

1. 基本操作步驟　PCR反應基本步驟是在反應管中加入PCR反應緩沖液、dNTP、引物、DNA模板和耐熱DNA聚合酶，混勻后加石蠟油封蓋防止反應液的揮發（目前有些PCR儀在無特殊要求時可不用石蠟油封），然后將反應管置于PCR儀中開始以下循環反應。①變性（Denature）：模板DNA在95℃左右的高溫條件下氫鍵斷裂，雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNA并游離于反應液中。②退火（Annealing）：人工合成的兩條寡核苷酸引物在適當溫度下分別與模板DNA擴增區域的兩端按堿基互補配對結合，此時，DNA聚合酶便可開始合成新鏈。由于添加的引物分子數遠大于模板DNA的分子數，因此引物與模板DNA形成復合物的幾率遠遠高于DNA分子自身的復性。③延伸（Extension）：在4種dNTP底物及Mg2+存在的條件下，耐熱DNA聚合酶在最適溫度下將單核苷酸按堿基互補配對原則從引物的3'端摻入，使引物沿5'→3'方向延伸合成新股DNA。每一循環的產物再作為下一循環的模板。

整個PCR反應一般須進行30輪的循環。在最初的循環階段，原來的DNA鏈起著模板的作用，隨著循環次數增加，新合成的引物延伸鏈急劇增多而成為主要模板，因此PCR擴增產物將受到所加引物5'末端的限制，使終產物序列介于兩種引物5'末端之間的區域。

2. 條件優化　PCR方法操作簡便，但影響因素頗多，因此需要根據不同的目的及不同的DNA模板，探索最適條件，以獲得最佳反應結果。以下主要從反應的特異性、敏感性、忠實性及擴增效率等四個方面討論PCR反應條件的優化。

（1）PCR反應循環參數：①變性：變性溫度過高或變性時間過長都會導致耐熱DNA聚合酶活性的喪失，從而影響PCR產物的產量。但變性溫度過低或變性時間過短則會導致DNA模板變性不完全，使引物無法與模板結合，同樣會導致PCR反應的失敗。通常情況下，95℃變性20～30 s即可使各種DNA分子完全變性。②退火：引物與模板的退火溫度由引物的長度及G＋C含量決定。退火溫度一般應比Tm值低3℃～12℃（5℃為宜，但不應超出15℃）。增加退火溫度可減少引物與模板的非特異結合，提高PCR反應的特異性；降低退火溫度則可增加PCR反應的敏感性。退火時間一般為20～40 s，時間過短會導致延伸失敗；時間過長則易產生引物二聚體或導致非特異性配對。③延伸：延伸溫度取決于所用耐熱DNA聚合酶的最適溫度，通常為70℃～75℃，一般不隨意更改。延伸時間取決于擴增片段的長度：目的片段小于500 bp時，延伸時間為20 s；目的片段在500～1200 bp時，延伸時間需40 s；目的片段大于1200 bp則還需增加延伸時間。另外，還可以500 bp/30 s為基準，根據目的片段長度計算反應時間。目的片段小于150 bp時甚至可以省略延伸步驟，因為退火溫度下DNA聚合酶的活性已足以完成短序列合成。④循環次數：主要取決于模板DNA濃度，一般為25～35次，此時PCR產物的積累即可達到最大值。在得到足夠產物的前提下應盡量減少循環次數。