多藥抗藥基因的表達實驗

大多MDR細胞膜上出現MDR-1基因及其基因產物P-糖蛋白過度表達。 多藥抗藥基因的表達實驗是通過反轉錄和PCR的方法來檢測這些特定基因的過度表達。

RNA

PBS 氯仿 異丙醇 萘酸 異硫氰酸肽 十二烷基肌酸鈉 構櫞酸鈉 乙酸鈉 二疏基乙醇 乙醇 Taq酶

離心機 紫外分光光度計 瓊脂糖凝膠電泳 PCR儀

一、細胞總RNA提取

1.  收集約5x10⁷個細胞，冷PBS洗滌。

2.  加入400 ul RNA提取液（含6 mol/l 的異硫氰酸肽，0.5%十二烷基肌酸鈉，0.025 mol/l 構櫞酸鈉pH7.0，0.25 mol/l 乙酸鈉，pH4.0，0.5%二疏基乙醇，50%萘酸），混勻。

3.  加入400 ul 氯仿，混勻，以13 000 r/min 于4℃離心15 min。

4.  取上清液加入等體積的異丙醇，4℃放置30 min。

5.  然后以13 000 r/min 離心15 min，吸上清，將RNA成點用75%的乙醇洗滌1次，溶于100 ul 的無菌雙蒸餾水中。

6.  并用紫外分光光度計檢測RNA純度（A₂₆₀/A₂₈₀應為1.8~2.0）后備用。

二、反轉錄及PCR擴增

1.  引物
 

2.  取細胞總RNA10 ul 加入20 ul AMV逆轉錄酶反應體系中，42℃保溫30 min 進行反轉錄，合成cDNA。

3.  然后置95℃，3 min 終止反轉錄。

4.  接著在Taq酶的作用下，用mdr-1和β₂-MG引物，對cDNA上的目的片段進行PCR

5.  94℃預變性2 min，然后94℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，擴增35個循環。

6.  最終在60℃保溫7 min，以保證產物充分延伸。

7.  取10 ul 擴增產物在3%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外燈下照相，與mdr-1 cDNA陽性對照，等位的DNA條帶為陽性，反之為陰性。

1. 盡可能在低溫下操作；

2. 適量斟酌Trizon等的用量；

3. 在每一次離心后除盡蛋白質、不溶物

提取操作時必須戴手套、口罩等防止DNA酶的影響；

4. 注意Trizon帶有腐蝕性；

5. 最重要的就是防止DNase的污染，手套、口罩必不可少，所用的槍頭和EP管等也要RNA提取專用的，無DNA酶的。