大前庭水管患者的PDS基因型分析

　　近年來國外的多項研究表明大前庭水管綜合征和Pendred綜合征（前庭水管擴大或伴內耳畸形、神經性聾和甲狀腺腫）與PDS（SLC26A4）基因突變有密切的關系。PDS基因含21個外顯子，開放閱讀框架2343 bp，編碼780個氨基酸的蛋白質Pendrin。Pendrin主要由疏水性氨基酸組成，屬于離子轉運體家族，研究表明其功能主要與碘/氯離子轉運有關。本文報道2個大前庭水管綜合征家庭，2個家庭子女均患有雙側感音神經性聾，顳骨CT檢查均提示患者的雙側前庭水管擴大，針對他們的基因型分析均發現PDS基因的雙等位基因突變。

　　家系1：例1、例2 為同卵雙生姐妹，9 歲，北京籍，普通小學就讀。均于7 歲時發現聽力下降，無明確誘因，聽力下降程度有波動，語言交流尚可，發聲略含糊。純音測聽提示：4耳均為感音神經性聾。最近一次純音測聽，平均語頻聽閾：例1 左側為75.0 dB HL（2年前為65.0 dBHL），右側為93.7 dBHL （2 年前為93. 7 dBHL）；例2 左側為86.2 dBHL（2年前為57. 5 dBHL），右側為65.0 dBHL（2年前為46.2 dBHL）。顳骨CT 檢查：例1、例2雙側前庭后方均見三角型骨質缺損，影像診斷均為大前庭水管（圖1）；甲狀腺B 超和甲狀腺功能檢查未見異常。父母聽力正常，非近親結婚，雙方家族內無其他耳聾患者。

　　雙側前庭水管擴大

圖1 　例1 的顳骨CT圖像

　　家系2：例3、4為兄妹，分別為24 歲和21 歲，內蒙古籍，例3大學已畢業，例4于2005年被某地方農業大學錄取，均于3歲時發現聽力下降。例3發病可能與應用鏈霉素和外傷有關，例4 無明顯誘因。聽力下降程度均有波動，進行性加重。純音測聽提示4 耳均為感音性聾。語頻純音平均聽閾：例3 左側為73.7 dBHL ，右側為83.7 dB HL；例4 左側為73.7 dBHL，右側為70.0 dB HL。例3甲狀腺B超提示小腺瘤，甲狀腺功能檢查未見異常；例4未查甲狀腺B 超和甲狀腺功能。父母聽力正常，非近親結婚，雙方家族內無其他耳聾患者。家長或本人均簽署耳聾基因檢測知情同意書。

　　另選無感音神經性聾病史者50 例為對照組。

　　采集受檢者外周血3 ml，應用試劑盒提取DNA（上海華舜生物工程有限公司），提取步驟參照試劑盒提供的使用說明進行。取適量提取的DNA 用紫外分光光度計進行定量和純度檢測，其余保存于-70℃備用。

　　擴增PDS 開放閱讀框架中的所有20 個外顯子，其中7 、8 外顯子同在一個擴增子內，11 、12 外顯子同在一個擴增子內，共擴增18 個片段以覆蓋PDS全部cDNA序列及每個外顯子前后的剪切區序列。對照組與待測患者的每個外顯子的PCR 產物各10μl混合，于95 ℃變性5 min后以每分鐘降低溫度1℃的速度進行復性，直至20℃。復性產物置于3500 HT DHPLC Wave system進樣區自動進樣，每次進樣5μl，不同外顯子采用1～3個不同柱溫（52. 5～66. 8℃）以實現最佳分離效果。

　　結果判定：若待測標本與對照組標本的混合物的過柱波形與對照組的過柱波形完全一致，為正常；待測標本與對照組標本混合物的過柱波形與對照組相比有前移、后移或有明顯的波形畸變，特別是出現2～4個波峰，判定為待測標本的擴增片段內可能存在序列變異，將此待測標本的擴增子進行全自動序列分析。全自動序列分析步驟參見ABI公司操作手冊。

　　根據大前庭水管散發病例的基因診斷經驗，首先進行例1～4 的7 + 8 外顯子的直接序列分析，測序結果表明例1 、例2 均為PDS IVS722 A2G 純合突變，例1 、2 的父母親序列分析結果均為PDS IVS722 A2G雜合突變（圖2），家系1 成員的表型和基因型共分離，父母均為大前庭水管致病基因攜帶者。

圖2 　家系1 全部個體的PDS IVS722 A2G序列圖

　　例4 PDS 1～20外顯子擴增產物與對照組的相應擴增產物混合液的DHPLC 過柱波形均與對照組各相應外顯子擴增產物相比較，其中例4 的第10外顯子的過柱波形與對照組明顯不同，對照組僅見1 個波峰，而例4 可見4 個分離的波形（圖3）。

　　進一步序列分析表明，例3 和例4 均攜帶1199 insT和T410M（1229 C-T）復合突變；例3、例4的父母親序列分析結果表明父親攜帶T410M（1229 C-T）雜合突變，母親攜帶1199 insT 突變（圖4）。家系2成員的表型亦與基因型共分離，父母均為大前庭水管致病基因攜帶者。

　　A ：對照組；B ：例4

圖3 　例4 PDS Exon10 異常DHPLC波形

圖4 　家系2 患者PDS Exon 10 復合突變的測序圖

　　對照組50例的基因檢測發現1 例為PDS IVS7-2 A-G雜合突變攜帶者，此例45歲，北京籍，無自覺聽力障礙，測聽顯示雙側高頻聽力輕度下降；DHPLC 篩查均未發現第10 外顯子擴增產物有異常波形。

　　大前庭水管綜合征是兒童、青少年中較為常見的一種內耳疾病，可表現為先天性或后天性感音神經性聾。Valvassori 和Clemis 于1978 年報告，在3700例聽覺或前庭功能障礙患者的顳骨多軌跡斷層攝影中，有50 例（1. 5%）前庭水管擴大，并將臨床上伴有感音神經性聽力損失等癥狀者稱之為“大前庭水管綜合征”。1985年Emmett報告，在2500例顳骨斷層攝影中發現大前庭水管26 例，其中5例為單側畸形，患側耳全部呈現感音神經性聾，而對側聽力皆正常。顯示大前庭水管有較高的發生率。

　　在西方，Pendred綜合征是一種常染色體隱性遺傳疾病，1996年Pendred綜合征基因被定位到染色體7q31，1997年PDS基因被克隆，并發現PDS基因突變導致Pendred綜合征和孤立的大前庭水管綜合征的發病（3～5）。

　　本研究采用DHPLC 配合測序方法進行分析，分析步驟先進行熱點區域的序列分析，若無熱點突變，以DHPLC 方法進行PDS 基因的全基因篩查，發現異常波形后再行序列分析，保證針對PDS 的基因診斷可以快速、有效、經濟地進行，PDS 基因分析結果表明4 例大前庭水管患者均具有雙等位基因突變，2 個家庭間的突變形式不同，同一個家庭中

　　不同患者的突變形式完全相同，2 個家庭中的父母均發現相應的單一雜合PDS 基因突變，符合其攜帶者身份。

　　在家系1 中發現的PDS IVS7-2 A-G 突變是PDS 基因第7 內含子距第8 外顯子起始2 個堿基位置的腺嘌呤至鳥嘌呤的置換，這一位置是重要的剪切部位，此突變可能造成第8 外顯子序列轉錄和翻譯異常而產生異常的Pendrin 蛋白。1999 年在一個土耳其近親家庭內發現的1143-2A-G突變（從發表的序列圖和作者描述的位置推算實際為919-2A-G，可能為作者核苷酸位置計算不同或錯誤）與IVS 7-2 A-G為同一位置突變，其中6 例耳聾患者具有114322A2G 純合突變，而家族內單一的1143-2A-G雜合突變攜帶者不發病，證明此突變是耳聾的致病基因[6]。在家系2 中發現的T410M 突變是一個已知突變[7]，此突變位于第10 外顯子，由1229 位點的C變為T，同時在此家庭檢測到的復合突變1199insT 亦位于第10 外顯子，這是一個未報道過的新突變，將導致Pendrin 蛋白在第400 位即發生變化，蛋白長度由780 氨基酸被截短至467氨基酸。2 個家系的3 種突變均來自他們的父母，不支持3 種突變類型是新生突變的可能性。

　　在對照組的50 例中發現1 例攜帶PDS IVS7-2A-G突變，即100 條染色體中發現一條染色體含有PDS IVS7-2 A-G 突變，一定程度上反映PDS IVS7-2 A-G突變在我國正常人群中有較高的攜帶率，這也是國人大前庭水管發病率較高的遺傳學基礎。

　　在我國，罕見有典型的Pendred 綜合征的報道，但是大前庭水管綜合征的發病比例較高[8]。關于大前庭水管綜合征的分子病因未見報道，本研究選用的病例均具有一個家庭2 個子女患病的特點，首先表現出一定的遺傳特質，所有患者的特點均具有一定的殘余聽力，甲狀腺功能無異常，具有較好的語言交流能力和學習能力，能夠在正常學校進行學習或完成學業。患者的臨床特點與西方Pendred綜合征患者的重度先天性聾、甲狀腺功能異常和甲狀腺腫有一定的區別，表明PDS 基因突變引起的表型特征亦具有人種差異。

　　本研究在2 個大前庭水管家系均發現PDS 基因的純合突變和復合突變，從遺傳學角度證實此病為常染色體隱性遺傳疾病，PDS 基因分析和診斷方法的建立將有利于此病的準確診斷和早期診斷，通過正確的指導保證患者殘余聽力的維持，并可通過優生、優育手段預防此類新生兒的再出生。