大小排阻層析法純化放射性標記的寡核苷酸實驗

氯仿 EDTA 乙醇 酚：氯仿 乙酸鈉 TE Tris-Cl Tris-SDS 層析緩沖液 放射性標記的寡核苷酸 純化的原料

凝膠過濾樹脂 破璃棉 巴斯德吸管

材料

溶液和緩沖液
稀釋貯存液至適當濃度。

氯仿
任選，見步驟 7。

EDTA(0.5mol/L,pH8.0)

乙醇

酚：氯仿
任選，見步驟 7。

乙酸鈉（3mol/L,pH5.2）
任選，見步驟 7。

TE(pH7.6)

Tris-Cl(1mol/L pH8.0)
任選，見步驟 7。

Tris-SDS 層析緩沖液
10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)
0.1%(m/V)SDS

核酸和寡核苷酸

放射性標記的寡核苷酸

純化的原料為方案 2(步驟 3 或步驟 5) 的反應混合液，T4 噬菌體多核苷酸激酶已在 68°C 滅活。

專用設備

凝膠過濾樹脂（Bio-Gel P-60 fine-grade 或 Sephadex G-15)
Bio-Gel P-60(精細級）可以從 Bio-Rad 公司購買，大多數化學試劑供應商可提供 Sephadex G-15(如 Sigma 公司）。Bio-GelP-60 是預脹后產品，而 Sephadex G-15 則必須在使用前膨脹及平衡。

破璃棉
用鋁箔包裹少置的玻璃棉，按包裹物的滅菌程序在 15psi(1.05 kg/cm2) 下高壓滅菌微量離心管（1.5 ml) 放于管架或收集器用于收集放射性標記的寡核苷酸層析洗脫液。

巴斯德吸管

附加試劑

步驟 6 需要的試劑列于第 13 章的方案 7。

方法

1. 有放射性標記的寡核苷酸的微量離心管中加入 30ul 20 mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液。在準備大小排阻樹脂時，將樣品保存于 0°C。
為方便起見，本方案以 Bio-GelP-60 樹脂為例，亦可同樣有效地應用于 SepbadexG-15。

2. 用消毒巴斯德管制備 Bio-GelP-60 層析柱。

a. 用 10 倍體積的 Tris-SDS 層析緩沖液平衡廠家提供的 Bio-Gel P-60 樹脂。
如果有離心蒸發器（Savant SpeedVac 或類似設備）, 可以用 0.1% 的碳酸氫銨溶液裝 Bio-Gel P-60 層析柱及沖洗，收集的含放射性標記的寡核苷酸組分可以用離心蒸發器干燥（步驟 6), 而不須用有機溶劑抽提或乙醇沉淀寡核苷酸。

b. 將一團滅菌后的玻璃棉塞入消毒的巴斯德吸管底部。
玻璃毛細管亦可作為很好的填塞工具。.

c. 準備好層析管后，倒入少量 Tris-SDS 層析緩沖液，檢查緩沖液流速（以數秒一滴為宜)。

d. 將 Bio-GelP-60 樹脂漿倒入層析管。樹脂隨重力下沉，緩沖液流出，柱身迅速形成。再加入樹脂漿，使玻璃棉塞至吸管頂端附近的縊痕處完全被充填。

e. 用 3 mlTris-SDS 層析緩沖液沖洗柱子。
重要勿讓層析管流干。必要時用封口膜封住管底。

3. 用吸管吸去樹脂上端多余的緩沖液，然后迅速將放射性標記的寡核苷酸加到樹脂上
(體積 100ul 或稍小）。

4. 樣品進入層析樹脂后，立即加入 100ul 緩沖液，待緩沖液進入樹脂后，即刻連續補充新的緩沖液，不要讓層析柱流干。

5. 用手提式微型探測儀檢測放射性標記寡核苷酸的流動。待流出液開始出現放射性時, 用微量離心管收集兩滴液體。
警惕：磷酸化反應常常使用大于 100uCi 放射性標記的 ATP, 因此上清中放射性劑量相當可觀，應小心、謹慎處理未摻入的放射性標記物、移液器吸頭及微量離心管。

6. 當放射性液體接近全部流出時，用液閃儀測量各組分的切倫克夫計數（見附錄 8）。如果快速移動的洗脫峰（放射性標記的寡核苷酸）與移動較慢的未摻入的 [γ-³²P]ATP 能明顯分離，可以合并所有含放射性標記寡核苷酸的組分。如果各峰分離不明顯，即取每一組分各約 0.5ul，用測定結合于 DE-81 濾膜放射性（詳細方法可參閱第 13 章的方案 7 中步驟 3) 或薄層層析方法分析。再合并不含未摻入放射性 [γ-³²P] 的放射性標記寡核苷敢組分。

7. 如放射性標記的寡核苷酸用于酶促反應，應進行下列步驟。否則，進行步驟 8。

a. 用等體積酚-氯仿抽提合并的標記寡核苷酸組分。

b. 用 50ul10 mml/LTris-Cl(pH8.0) 反向抽提有機相，并合并兩次的水相。

c. 用等體積氯仿抽提合并的水相。

d. 加入 0.1 體積 3mol/L 乙酸鈉（pH5.2), 簡單混旋，再加 3 倍體積的乙醇，0°C 放置 30 min。4°C 下以最大轉速離心 20 min 用裝有一次性吸頭的微量移液器吸去管中的乙醇（放射性含量很低)。

8. 在離心管中加入 500ul80% 的乙醇，稍加振蕩，再以最大轉速離心 5 min。

9. 用裝有一次性吸頭的微量移液器吸去管中的乙醇。將離心管打開管口，放置在試驗臺聚異丁烯酸樹脂有機玻璃防護屏后，直到剩余的乙醇揮發干凈。

10. 用 20ulTE(pH7.6) 溶解沉淀的寡核苷酸，于-20°C 保存。