大腸桿菌感受態細胞的幾種制備方法protocol1

常態的細胞不能攝入外部溶液中的DNA，所以要轉化質粒DNA進入大腸桿菌必須首先制備感受態的大腸桿菌細胞。受體細胞經過一些特殊方法（如：CaCl，RuCl等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生變化，成為能容許多有外源DNA的載體分子通過的感受態細胞(competent cell) 。

轉化，是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。 進入細胞的DNA分子通過復制表達，才能實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。轉化過程所用的受體細胞一般是限制－修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。

α-互補現象：因為許多載體都帶有一個LacZ基因的調控序列和頭146個氨基酸的編碼信息，編碼α-互補肽，該肽段能與宿主編碼的缺陷型β-半乳糖苷酶實現基因內互補（ α-互補）。當這種載體轉入可編碼?－半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞中時，在異丙基-?-D硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導下，宿主可同時合成這兩種肽段，雖然它們各自都沒有酶活性，但它們可以融為一體形成具有酶活性的蛋白質。所以稱這種現象為α-互補現象。由互補產生的α－半乳糖苷酶(LacZ)能夠作用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β－D－半乳糖苷(X-gal)而產生藍色的菌落，所以利用這個特點，在載體的該基因編碼序列之間人工放入一個多克隆位點，當插入一個外源DNA片段時，會造成LacZ(α)基因的失活，破壞α-互補作用，就不能產生具有活性的酶。所以，有重組質粒的菌落為白色，而沒有重組質粒的菌落為藍色。

大腸桿菌感受態細胞的幾種制備方法：

方法一：

細菌轉化的方法多以Mendel和Higa（1970）的發現為基礎，其基本方法是用冰預冷

CaCl2或多種2價陽離子等處理細菌，使之進入感受態得以轉化。用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態細胞，常用于成批制備感受態細菌。本法適用于大多數大腸桿菌菌株，且迅速、重復性好。

實驗步驟：

1、從37℃培養16～20h的新鮮平板中挑取一個單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16～20h過夜培養物，轉到一個含有100mlLB培養基的1L或500ml燒瓶中。于37℃劇烈振搖培養約2～3h（旋轉搖床200～300r/min），每隔20～30min測量OD600值≈0.4。

2、在無菌條件下將細菌轉移到一個，用冰預冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10～20min。

3、于4℃用SorvallGS2轉頭（或與其離心管相配的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞。

4、倒數培養液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養液流盡。

5、以10ml用冰預冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上。4 h

6、于4℃用SorvallGS3轉頭（或與其相應的轉頭）以4000r/min離心10min，以回收細胞。

7、倒出培養液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養液流盡。

8、每50ml初始培養物用2ml冰預冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定，此時，可以迅速將細胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存備用。

9、用冷卻的無菌吸頭從每種感受態細胞懸液中各取200μl轉移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應混合物（體積≤10μl，DNA≤50ng），輕輕旋轉以混勻內容物，在冰中放置30min。

10、將離心管放到預加溫到40℃的循環水浴中的試管架上，放置90s～2min，不要搖動試管。

11、快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻1～2min。

12、每離心管加800μlSOC培養基，用水浴將培養基加溫到37℃，然后將管轉移到37℃搖床上，溫育45min使細菌復蘇，并且表達質粒編碼的抗生素抗性標記基因。
13、將適當體積（每個90mm平板可達200μl）已轉化的感受態細胞轉移到含200mmol/l MgSO4和相應抗生素的SOB培養基上

14、將平板置于室溫至液體被吸收。

15、倒置平皿，于37℃培養，12～16h后可出現菌落。

方法二：

CASsuper One-Step Competent Cell Preps Kit 采用一種簡單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態細胞，便于質粒DNA的轉化，可滿足一般實驗的要求。與CaCl2法相比具有多種優點：使用方便，只需一步即可完成感受態細胞的制備；轉化效率略高于CaCl2法，一般可達106-108cfu/μg，滿足一般實驗需要；感受態細胞制成后即可保存于 -70℃,無須加入甘油，并且經長期保存活力無明顯下降。

1、從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在LB平板上劃線，37度過夜至長出單菌落。挑形態飽滿的單菌落2個，分別接種5ml LB培養基中，37℃，250rpm， 過夜培養。

2、次日從5ml LB培養物吸取200μl轉入50ml LB培養基中（250ml 錐形瓶），37 ℃，250rpm培養2小時，此時OD600約0.4—0.5。

3、吸取1ml菌液到1.5ml離心管里，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。

4、加入100μl預冷的Solution A，懸浮菌體，冰浴30分鐘。

5、此時感受態細胞已經制成可立即使用或-70℃保存。

注意事項：

1、所用器具一定要清潔；

2、操作步驟2 中培養基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高于此值：500ml 錐形 瓶裝100ml培養基，250ml錐形瓶裝50ml培養基；

3、在收獲菌體前半小時還可以在培養基中加入20mM的MgCl2 ，效果會更好一些；

4、為保證細胞處于對數生長期，培養后的菌體的OD值不要高于0.6；

5、制備感受態細胞時所有操作盡量保證在冰上操作；

6、細胞轉化操作步驟6中也可以不必進行熱擊，冰浴后直接加入新鮮LB，簡化操作步驟，但轉化效率低于熱擊方法，適用于對轉化率要求不高的實驗。

方法三：

1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2ml LB培養基的試管中，37℃振蕩培養過夜。

2、取0.1ml過夜培養物轉種于含10ml LB培養基的三角瓶中，37℃振蕩培養3h至OD600=0.3。

3、然后把培養物倒入1.5ml離心管中，冰浴10min。

4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液 。

5、把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min 。

6、然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液 。

7、將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。