大腸桿菌感受態細胞制備和轉化

實驗概要

轉化是將外源基因引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。轉化過程所用的受體細胞經過一些特殊方法處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性改變，成為允許外源DNA分子進入的狀態，這種細胞稱為感受態細胞。進入受體細胞的DNA分子通過復制，表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子（即帶有異源DNA分子的受體細胞）。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl₂和RbCl法。制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油，并于-70℃保存。

本實驗以E.coli DH5α菌株為受體細胞，并用CaCl₂處理，使其處于感受態，然后與pUC18質粒共保溫，實現轉化。由于pUC18質粒帶有氨芐青霉素抗性基因（Amp^r）,可通過Amp抗性來篩選轉化子。如受體細胞沒有轉入pUC18，則在含Amp的培養基上不能生長。能在Amp培養基上生長的受體細胞（轉化子）肯定已導入了pUC18。轉化子擴增后，可將轉化的質粒提出，進行電泳、酶切等進一步鑒定。

主要試劑

Ecoli DH5α菌株，pUC18質粒DNA，LB固體和液體培養基，Amp母液，含Amp的LB固體培養基，麥康凱培養基（Maeconley agar），0.05mol/LCaCl₂溶液, 含15%甘油的0.05mol/L CaCl₂

實驗步驟

1．受體菌培養

從LB平板上新活化的Ecoli DH5α單菌落,接種于3～5ml LB液體培養基中,37℃下振蕩培養12小時左右,直至對數生長后期.將該菌懸液以1：100～1：50的比例接種于100mlLB液體培養基中，37℃振蕩培養2～3小時至OD₆₀₀=0.5左右。

2．感受態細胞制備（CaCl₂法）

（1）       將培養液轉入離心管中，冰上放置10分鐘，然后于4℃下3000 g離心10分鐘。

（2）       棄去上清，用預冷的0.05mol/L的CaCl₂溶液10ml輕輕懸浮細胞,冰上放置15～30分鐘后,4℃下3000 g 離心10分鐘。

（3）       棄去上清，加入4ml預冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl₂溶液輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液。

（4）       感受態細胞分裝成200μl的小份，貯存于-70℃可保存半年。

3．轉化

（1）       從冰箱中取200μl感受態細胞懸液，室溫下使其解凍，解凍后立即置冰上。

（2）       加入pUC18質粒DNA溶液（含量不超過50ng，體積不超過10μl），輕輕搖勻，冰上放置30分鐘。

（3）       42℃水浴中熱擊90秒，熱擊后迅速置于冰上冷卻3～5分鐘。

（4）       向管中加入1ml LB 液體培養基（不含Amp），混勻后37℃振蕩培養1小時，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因（Amp^r）。

（5）       將上述菌液搖勻后取100μl涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養基吸收后倒置培養皿，37℃培養16～24小時。

同時做兩個對照：

對照組1：以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，其他操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的LB平板上應沒有菌落出現。

對照組2：以同體積的無菌雙蒸水代替DNA溶液，但涂板時只取5μl菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此組正常情況下應產生大量菌落。

（6）計算轉化率：統計每個培養皿中的菌落數。

轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下：

　　轉化子總數＝菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積／涂板菌液體積

　　轉化頻率（轉化子數／每mg質粒DNA）＝轉化子總數／質粒DNA加入量(mg)

　　感受態細胞總數＝對照組２菌落數×稀釋倍數×菌液總體積／涂板菌液體積

　　感受態細胞轉化效率＝轉化子總數／感受態細胞總數

注意事項

本實驗方法也適用于其它E.coli受體菌株的不同的質粒DNA的轉化。但它們的轉化效率并不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板,而有的轉化效率低,涂板時必須將菌液濃縮(如離心),才能較準確的計算轉化率。

1.  細胞生長狀態和密度:  不要用經過多次轉接或儲于４℃的培養菌，最好從－70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600  來控制。DH5α菌株的OD600 為0.5時,細胞密度在5×107  個/ml左右(不同的菌株情況有所不同),這時比較合適。密度過高或不足均會影響轉化效率。

　　2.   質粒的質量和濃度：用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA(cccDNA)。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的cccDNA即可使50μl  的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5％。

　　3. 試劑的質量： 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的(GR.或AR.),并用超純水配制,最好分裝保存于干燥的冷暗處。

　　4. 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管, tip頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌。