大腸桿菌感受態細胞的制備

實驗概要

大腸桿菌感受態細胞的CaCl₂法制備及質粒轉化。

實驗原理

處于對數生長期的細菌經CaCl₂ 處理后接受外源DNA的能力顯著增加。細菌處于容易吸收外源DNA的狀態叫感受態。
 

在自然條件下，很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中，一般缺乏此種轉移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態，以攝取外源DNA。
 

轉化（Transformation）是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體（R-，M-），它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法（如電擊法，CaCl₂，RbCl(KCl)等化學試劑法）的處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞（Compenent cells）。進入受體細胞的DNA分子通過復制、表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子（Transformant，即帶有異源DNA 分子的受體細胞）。目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl₂和RbCl(KCl)法，RbCl(KCl)法制備的感受態細胞轉化效率較高，但CaCl₂法簡便易行，且其轉化效率完全可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaCl₂法使用更廣泛。

主要試劑

1. 0.1mol/L CaCl₂溶液

2. LB液體培養基

3. 30%甘油：30mL甘油溶于100mL蒸餾水，高壓滅菌

主要設備

1. 超凈工作臺

2. 冷凍離心機

3. 恒溫搖床

4. －70℃冰箱

5. 10mL移液管

6. 吸耳球

7. 1mL、200μL移液槍（配套槍頭）

8. 50mL 離心管

9. 1.5mL離心管

實驗材料

大腸桿菌DH5α（R-，M-，Amp-）

實驗步驟

1. 受體菌的培養

   (1) 從LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α單菌落，接種于3～5mL LB液體培養基中，37℃下振蕩培養過夜（12h左右）；

   (2) 將該菌種懸液以1:100的比例接種，取250μL菌液轉接到25mL LB液體培養基中，37℃振蕩培養2～3h至OD600＝0.5左右。
 

2. 感受態細胞的制備

（注意：以下操作在超凈工作臺完成。） 

   (1) 將菌液轉入50mL離心管中，冰上放置10min；

   (2) 在4℃下，4000r/min離心10min。棄去上清，將管倒置1min以便培養液流盡；

   (3) 用冰上預冷的0.1mol/L的CaCl₂ 溶液10mL輕輕懸浮細胞，冰上放置30min；

   (4) 0～4℃ 4000r/min離心10min，棄去上清，加入2mL預冷的0.1mol/L的CaCl₂ 溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置（務必冰上放置）。

（注意：以上操作完成了新鮮感受態細胞的制備）
 

3. 感受態細胞的分裝與凍存

   (1) 在2mL制備好的感受態細胞中加入2mL30%甘油（即1:1體積，甘油終濃度15%）；

   (2) 將此感受態細胞分裝成每份200μL (1.5mL dorf管)，液氮速凍，快速轉入-70℃冰箱保存。（如果沒有液氮，可以將分裝的感受態細胞直接轉入-70℃冰箱保存。）

注意事項

1. 細胞的生長狀態和密度
最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。不要用已 經過多次轉接，及貯存在4℃的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在5×10⁷個左右為佳。即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的OD600控制。對TG1菌株，OD600為0．5時，細胞密度在5×10⁷個/ml左右。（應注意OD600值與細胞數之間的關系隨菌株的不同而不同）。密度過高或不足均會使轉化率下降。 此外，受體細胞一般應是限制-修飾系統缺陷的突變株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。并且受體細胞還應與所轉化的載體性質相匹配。 

2. 試劑的質量
所用的CaCl₂等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4℃。

3. 防止雜菌和雜DNA的污染
整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入。

4. 整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。