如何利用CRISPRdCas9來研究基因調控

　　順式調控元件（TRE）和反式調控元件（CRE）一直是人們感興趣的對象，通常利用染色質免疫沉淀（ChIP）和染色質捕獲技術來研究。不過，德克薩斯大學西南醫學中心的研究人員最近開發出一種新方法，結合CRISPR的靶定能力以及生物素-鏈霉親和素的互作優勢來鑒定TRE和CRE。

　　這種名為CAPTURE的方法利用生物素標記的dCas9來分離與天然的染色質背景相互作用的調控元件（CRE和TRE）。CAPTURE包括三個關鍵的組分：1) 帶有生物素接受位點的dCas9；2) 生物素連接酶BirA，它將生物素添加到接受位點；3) 將生物素化的dCas9引到目的位點的gRNA。靶定之后，通過甲醛交聯來固定蛋白與DNA相互作用。之后就是個性化的實驗方案了。

　　捕獲TRE

　　如果目標是TRE，則將染色質打斷成小片段，通過生物素-鏈霉親和素免疫沉淀將與dCas9關聯的片段拉出，并通過質譜開展分析。這個版本稱為CAPTURE-Proteomics。它可回答的問題與ChIP有點類似，但不是用TRE作為誘餌，而是用DNA作為誘餌來分離相關的TRE。CAPTURE不需要預先知道哪些TRE參與基因調控，也不需要ChIP級別的抗體。

　　就技術而言，CAPTURE與另一種ChIP方法非常相似，前者是利用生物素標簽來純化，而后者是利用Protein A標記的dCas9以及抗體純化。相比之下，生物素-鏈霉親和素之間的親和力要比抗原-抗體的互作要高得多，這不僅增加了檢測的靈敏度，也提高了特異性。

　　捕獲CRE

　　如果目標是CRE，則用DpnII限制性酶消化DNA，并將末端連接在一起形成DNA環。這個過程可以連接看似遙遠但實際靠近的DNA片段（如啟動子和增強子的相互作用）。然后，將這些DNA環打斷成較小的片段，同樣利用生物素-鏈霉親和素互作將與dCas9相連的片段拉出，接著開展雙端測序。這種方法被稱為CAPTURE-3C-Seq。它與其他染色質捕獲方法（3C、4C、5C、Hi-C）類似，但不需要PCR擴增，且分辨率更高。

　　CAPTURE-3C-Seq的另一個好處在于它可以實現多重檢測，一次表達多個gRNA。這是因為在樣本處理過程中，感興趣的DNA序列與CRE有著物理連接。不過，值得一提的是，CAPTURE-Proteomics不適用于多重檢測，因為TRE和DNA之間的連接丟失。

　　為了展示CAPTURE的應用，研究人員主要研究了β珠蛋白基因座。這個基因座之前被充分研究過，帶有許多TRE和CRE。此外，他們還研究了疾病相關突變以及發育如何影響TRE或CRE的位置。總之，這種全面和無偏向的分析有助于人們了解發育和疾病過程中的基因組結構和功能。