如何制備透射電鏡的樣品？

　　透射電鏡樣品制備方法

　　樣品在2.5%的戊二醛溶液中4℃固定過夜，然后按下列步驟處理樣品：

　　倒掉固定液，用0.1M，pH=7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min；

　　用1%的鋨酸溶液固定樣品1-2h；

　　倒掉固定液，用0.1M，pH=7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品三次，每次15min；

　　用梯度濃度（包括50%，70%，80%，90%和95%五種濃度）的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度處理15min，再用100%的乙醇處理一次，每次20min；最后過度到純丙酮處理20min；

　　用包埋劑與丙酮的混合液（V/V=1/1）處理樣品1h；

　　用包埋劑與丙酮的混合液（V/V=3/1）處理樣品3h；

　　純包埋劑處理樣品過夜；

　　將經過滲透處理的樣品包埋起來，70℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在Reichert超薄切片機中切片，獲得70-90nm的切片，該切片經檸檬酸鉛溶液和醋酸雙氧鈾50%乙醇飽和溶液各染色15min，即可在透射電鏡中觀察。

　　TEM樣品包埋塊制作有關注意事項

　　一、取材：

　　1、動作迅速：組織離體后，應將其快速放入固定液中，使組織細胞盡可能保持原來的生活狀態；

　　2、減少損傷：選擇鋒利切割器械，減少牽拉或擠壓組織；

　　3、組織塊大小：一般要小于1mm³。

　　二、固定：

　　固定是指用化學固定劑或一些物理方法迅速殺死細胞的過程，目的是盡可能保持細胞的原有生活狀態，不發生位移，減少組織結構變化。固定劑的主要作用是使蛋白質、脂質等生物大分子發生某種交聯。

　　1、用固定液固定的樣品若漂浮在溶液表面，應通過抽真空的方法讓樣品沉入溶液中

　　2、使用鋨酸的注意事項

　　（1）通風櫥中的鋨酸溶液為2%的儲備液，使用之前需用0.2MPBS或二甲砷酸鹽緩沖液稀釋成1%的鋨酸溶液。

　　（2）鋨酸為劇毒、極易揮發的試劑，必須在通風櫥中操作，廢液必須收集在密閉容器中。第一次使用鋨酸的同學，請務必獲得老師或其它熟悉操作人員的指導。

　　三、漂洗：

　　應徹底漂洗干凈，減少固定液與固定液或與脫水劑之間的反應。

　　四、脫水：

　　脫水是將組織中的游離水徹底清除的過程。由于常用的包埋劑大都是非水溶性樹脂，只有將生物組織中的游離水清除干凈，包埋劑才能浸入組織。

　　脫水過程中應注意：

　　（1）逐級脫水而不能急劇脫水；

　　（2）更換溶液時動作要快，特別是不要讓組織離開溶液，否則會在組織內外產生氣泡；

　　（3）脫水過程中若要長時間停留或過夜，應放在70%脫水劑中，并在4℃保存。

　　五、滲透

　　滲透就是用包埋劑逐漸取代組織中的脫水劑，使細胞內外空隙被包埋劑所填充。包埋劑通常由樹脂、硬化劑、增塑劑及催化劑4種試劑按一定比例配制而成。

　　包埋劑配制及使用過程中的注意事項：

　　（1）所有容器及玻璃棒等應是清潔和干燥的；

　　（2）配制過程中應攪拌均勻，使用過程中應避免異物，特別是水、乙醇、丙酮等混入包埋劑；

　　（3）配制好的包埋劑應密封保存，避免受潮。剩余包埋劑可密封并儲存在-10—-20℃冰箱中，延長其使用期。