如何檢測crispr基因敲除成功

CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一種來自細菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫機制。在細菌及古細菌中，CRISPR系統共分成3類，其中Ⅰ類和Ⅲ類需要多種CRISPR相關蛋白（Cas蛋白）共同發揮作用，而Ⅱ類系統只需要一種Cas蛋白即可，這為其能夠廣泛應用提供了便利條件[1]。

目前，來自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9 蛋白（含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA 兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然后通過PAM序列結合并侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。

由于PAM序列結構簡單（5’-NGG-3’），幾乎可以在所有的基因中找 到大量靶點，因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統[1]。

通過基因工程手段對crRNA和tracrRNA進行改造，將其連接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有與野生型RNA類似的活力，但因為結構得到了簡化更方便研究者使用。通過將表達sgRNA的原件與表達Cas9的原件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，將其轉染細胞，便能夠對目的基因進行操作[2,3]。

目前常用的CAS9研究方法是通過普通質粒,質粒構建流程如下：

Cas9質粒構建

目前常見的CAS9普通質粒有（漢恒生物提供cas9質粒試劑盒）：

雖然普通質粒很多時候也能達到實驗效果，但是質粒轉染具有效率低，作用時間短暫性等缺點。病毒的出現解決了質粒這些問題，常用的病毒主要有慢病毒和腺病毒，慢病毒常用質粒見addgene（lentiCRISPR v2，lentiGuide-Puro，lentiCas9-Blast），慢病毒可以整合入宿主基因組中，長期穩定的表達（漢恒生物提供CRISPR/cas9 慢病毒包裝），但是由于慢病毒克隆能力有限而CAS9本身分子量比較大（大于4kb），且長期插入可能導致亂切，脫靶等，同時慢病毒包裝最終獲得的滴度不高等原因，腺病毒更有優勢，腺病毒克隆能力強，獲得的病毒滴度也高。同時相對于普通質粒來說，作用是時間也比較長，可以達到更理想的敲除效果。