如何篩選動物單克隆抗體

單克隆抗體制備過程中,總共有兩次篩選,第一次篩選出雜交瘤細胞,第二次篩選出能產生特異性抗體的雜交瘤細胞,兩次篩選的原理和方法是不相同的.
第一次篩選的原理與方法：細胞融合后,雜交瘤細胞的選擇性培養是第一次篩選的關鍵.普遍采用的HAT選擇性培養液是在普通的動物細胞培養液中加入次黃嘌呤（H）、氨基喋呤（A）和胸腺嘧啶核苷酸（T）.其依據是細胞中的DNA合成有兩條途徑：一條途徑是生物合成途徑（“D途徑”）,即由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸,為DNA分子的合成提供原料.在此合成過程中,葉酸作為重要的輔酶參與這一過程,而HAT培養液中氨基喋呤是一種葉酸的拮抗物,可以阻斷DNA合成的“D途徑”.另一條途徑是應急途徑或補救途徑（“S途徑”）,它是利用次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）催化次黃嘌呤和胸腺嘧啶核苷生成相應的核苷酸,兩種酶缺一不可.因此,在HAT培養液中,未融合的效應B細胞和兩個效應B細胞融合的“D途徑”被氨基喋呤阻斷,雖“S途徑”正常,但因缺乏在體外培養液中增殖的能力,一般10d左右會死亡.對于骨髓瘤細胞以及自身融合細胞而言,由于通常采用的骨髓瘤細胞是次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核苷轉移酶缺陷型（HGPRT）細胞,因此自身沒有“S途徑”,且“D途徑”又被氨基喋呤阻斷,所以在HAT培養液中也不能增殖而很快死亡.惟有骨髓瘤細胞與效應B細胞相互融合形成的雜交瘤細胞,既具有效應B細胞的“S途徑”,又具有骨髓瘤細胞在體外培養液中長期增殖的特性,因此能在HAT培養液中選擇性存活下來,并不斷增殖.
第二次篩選的原理和方法：在實際免疫過程中,由于采用連續注射抗原的方法,且一種抗原決定簇刺激機體形成相對應的一種效應B淋巴細胞,因此,從小鼠脾臟中取出的效應B淋巴細胞的特異性是不同的,經HAT培養液篩選的雜交瘤細胞特異性也存在差異,所以必須從雜交瘤細胞群中篩選出能產生針對某一預定抗原快定簇的特異性雜交瘤細胞.通常采用有限稀釋克隆細胞的方法,將雜交瘤細胞多倍稀釋,接種在多孔的細胞培養板上,使每一孔含一個或幾個雜交瘤細胞（理論上30%的孔中細胞數為0時,才能保證有些孔中是單個細胞）,再由這些單細胞克隆生長,最終選出分泌預定特異抗體的雜交細胞株進行擴大培養.