如何選擇層析方法

當目標蛋白的物理特性如分子量、等電點等都不清楚時，可用PAGE電泳方法或層析方法加以測定。分離范圍廣闊的Superose HR適合測定未知蛋白的分子量。用少量離子交換介質在多個含不同pH緩沖液的試管中，可簡單地測出pI， 并確定純化用緩沖液的最佳pH。

選擇層析方法

在對目標蛋白的特性或樣品成分不太了解，可嘗試幾種不同的純化方法：

　　一、使用最通用的凝膠過濾方法，選擇分離范圍廣泛的介質如Superose、Sephacryl HR根據分子量將樣品分成不同組份。

　　二、用含專一配體或抗體的親和層析介質結合目標蛋白。也可用各種活化偶聯介質偶聯目標蛋白的底物、受體等自制親和介質，再用以結合目標蛋白。一部即可得到高純度樣品。

　　三、大體積的樣品、常使用離子交換層析加以濃縮及粗純化。高鹽洗脫的樣品，可再用疏水層析純化。疏水層析利用高鹽吸附、低鹽洗脫的原理，洗脫樣品又可直接上離子交換等吸附性層析。兩種方法常被交替使用于純化流程中。

純化大量粗品

處理大量原液時，為避免堵塞柱子，一般使用Sepharose Big Beads、SepharoseXL、Sepharose Fast Flow等大顆粒離子交換介質。擴張柱床吸附技術利用多種STREAMLINE截止，直接從含破碎細胞或組織萃取物的發酵液中俘獲蛋白。將離心、超濾、初純化結合為一，提高回收率，縮短純化周期。

純化硫酸氨樣品

硫酸氨沉淀方法常被用來初步凈化樣品，經處理過的樣本處于高鹽狀態下，很適合直接上疏水層析。若作離子交換，先用HiTrap HIC Test  Kit和RESOURCE HIC Test KIT可在八種疏水介質中選擇最適合介質及最佳的純化條件。低鹽洗脫的樣品可稍加稀釋或直接上其他吸附性層析。

純化糖類分子

固化外源凝集素如刀豆球蛋白、花生、大麥等的凝集素，結合碳水化合物的糖類殘基，很適合用作分離糖化細胞膜組分、細胞、甚至亞細胞細胞器，純化糖蛋白等。附上外源凝集素的Sepharose 6MB親和層析介質，可俘獲整個細胞或大復合物，如膜囊等。

純化膜蛋白

膜蛋白分離長使用去污劑使其保持活性。離子性去污劑應選用與目標蛋白電荷相反者，以避免在作離子交換時蛋白競爭交換介質，藉此除去去污劑。非離子性去污劑可用疏水層析法除去。

純化單抗、抗原

單抗多為IgG，來源主要是腹水和混合瘤培養上清夜。腹水有大量白蛋白、轉鐵蛋白和宿主抗體等。Protein G和ProteinA對IgG的Fc區有專一性親和作用，能一步醇化各種不同源的IgG。血清互補劑如小牛血清可先用蛋白G預處理，在培養前除去IgG。

重組蛋白A介質rProtein A Sepharose FF對IgG有更高的栽量和專一性，基團脫落更少。脫落的rProtein A用離子交換Q Sepharose   Hp或凝膠過濾Superdex 200，很容易去除。   疏水層析pheny1 Sepharose HP也很適合純化IgG。

宿主抗體和污染IgG可用凝膠過濾Superdex 200在精細純化中去除。純化IgG抗原最有效的方法是用活化偶聯介質如CNBr、NHs activated Sepharose FF偶聯IgG，再進一步獲取IgG抗原。 HiTrap IgM是用來純化融合瘤細胞培養的單抗IgM，結合量達5mg IgM。HiTrap IgY是專門用來從蛋清里純化IgY，結合量達100  mg純IgY。

純化重組蛋白

重組蛋白在設計、構建時應已融化入純化構想。樣品多夾雜了破碎細胞或溶解產物，擴張柱床吸附技術STREAMLINE便很適合作粗分離。