孔令義／汪俊松團隊聯合研究成果揭示衣康酸抗炎機制

　　細胞對免疫應答的代謝適應，也稱為免疫代謝，在調節細胞免疫功能上發揮著重要地位。巨噬細胞是先天免疫系統的主要組成部分，在機體的主動防御和維持內環境穩態上起著至關重要的作用。巨噬細胞存在M1（促炎）和M2（抗炎）兩種表型，M1型巨噬細胞以高增殖和對免疫刺激的迅速應答為特征，可以被LPS活化，在此過程中很多代謝物的水平會發生變化，能量代謝從氧化磷酸化轉變為有氧糖酵解。M1型巨噬細胞采用能量產生效率低下的有氧糖酵解，是因為其對能量的快速產生和生合成原料有很高要求，以滿足其增殖和生合成需要。GAPDH是糖酵解的限速酶，催化從甘油醛3-磷酸到1,3-二磷酸甘油酸。顯著上調的糖酵解和GAPDH活性的升高是活化的巨噬細胞的特征。

　　衣康酸是一種免疫代謝物（immunometabolite），具有顯著的抗炎效果，但對于其機制仍然沒有被充分理解。衣康酸是三羧酸中間體順烏頭酸在順烏頭酸脫羧酶的催化下脫羧形成的五碳二羧酸 ，含有α, β-不飽和羧酸結構。很多含有這一片段的內源性代謝物可以通過邁克爾加成反應烷基化蛋白的半胱氨酸殘基，例如富馬酸酯可以烷基化KEAP1和GAPDH。那么衣康酸是否也能烷基化GAPDH，從而抑制糖酵解而發揮其抗炎作用了？

　　2019年11月8日，中國藥科大學孔令義教授團隊與南京理工大學分子代謝中心汪俊松教授團隊合作在Nature Communications在線發表了題為4-Octyl itaconate inhibits aerobic glycolysis by targeting GAPDH to exert anti-inflammatory effects的研究論文，揭示了4-辛基衣康酸（4-OI）靶向GAPDH，抑制糖酵解而發揮抗炎作用。

　　衣康酸本身極性很大，不利于透膜開展細胞試驗。作者采用了其衍生物4-辛基衣康酸（4-OI）開展了后繼實驗。LC-MS/MS蛋白質譜對4-OI 處理過的RAW264.7細胞進行檢測，顯示4-OI直接作用于GAPDH上的22位半胱氨酸殘基。作者進一步使用重組的小鼠GAPDH，發現4-OI可以烷基化 Cys 22和Cys 245 (不影響GAPDH活力)。4-OI降低了細胞外酸化率，增加了細胞內的耗氧量。作者進一步用同位素標記的U13C-glucose進行了代謝流分析，發現4-OI增加了LPS刺激的BMDM細胞中GAPDH上游代謝物二羥丙酮磷酸的含量，減少了其下游代謝物乳酸含量，證明了4-OI在GAPDH這一關鍵節點處阻斷了糖酵解通量，抑制GAPDH活力是4-OI介導的糖酵解下調的原因。

　　Irg1 (Immunoresponsive gene 1) 是編碼順烏頭酸脫羧酶的基因，作者進一步檢測了野生型和Irg1-/ -BMDM細胞，發現GAPDH活性在LPS刺激的Irg1-/ -BMDM細胞中要遠高于野生型，并伴隨著顯著增加的乳酸含量和細胞外酸化率 (ECAR) 以及減少的氧消耗率(OCR)，證明了Irg1-/ -BMDM細胞中糖酵解明顯增強。炎癥因子在LPS刺激的Irg1-/ -BMDM細胞中也顯著升高，這些結果有力地說明阻止內源性衣康酸生成的增加抑制了GAPDH活性和糖酵解，進而促進炎癥。

　　為了進一步證實Cys 22在GAPDH中的重要地位，作者在RAW264.7巨噬細胞中過表達了WT GAPDH (GAPDH-WT) 和 Cys-22 mutant GAPDH (GAPDH-C22A) ，過表達的GAPDH-WT（而不是GAPDH-C22A）可以彌補4-OI 對炎癥因子的抑制效應，表明4-OI的抗炎效應就是源自于其對GAPDH Cys-22的烷基化。

　　糖酵解抑制劑2-deoxy-D-glucose（2-DG，己糖激酶的競爭性抑制劑），heptelidic acid （GAPDH抑制劑）重現了4-OI對炎癥因子的抑制效應，此外4-OI和heptelidic acid一樣，抑制了TNF-α的翻譯，但是對其轉錄沒有影響。4-OI, 2-DG和heptelidic acid 都能抑制nuclear factor-κB (NF-κB) 的核移位，減輕炎癥。在動物模型中，進一步確證了4-OI能夠減少乳酸含量，有效抑制炎癥釋放，增加膿毒血癥C57BL/6J小鼠的存活率。該研究對4-OI調控代謝重編程提出了新穎的見解，并強調了靶向有氧糖酵解在治療炎性疾病中的重要性，這為今后抗炎新藥的研發提供了新的思路。

　　原文鏈接：

　　https://www.nature.com/articles/s41467-019-13078-5.pdf