完整蛋白質從SDSPAGE膠中的電洗脫及其MALDITOFMS分析實驗

電泳緩沖液蛋白質染色液微量離心管

水平凝膠電泳儀器電洗脫試劑盒真空離心濃縮儀

3.1 蛋白質檢測

一 般而言，凝膠染色和脫色非常易于操作。在本實驗方法中，我們使用 ElectroBlue 染料代替有固定作用的考馬斯亮藍染色液顯色蛋白質（見注釋 1) 。



( 1 ) SDS-PAGE 電泳后，用 300 ml Milli-Q 水或去離子水漂洗凝膠（8 cm X 10 cm ) 3 次，每次 10 min。

( 2 ) 用 ElectroBlue 染料給凝膠染色，用大約 20 ml 染色液浸泡凝膠（8 cm X 10 cm)，緩慢搖動 2 h ( 見注釋 3 )。

( 3 ) 用 300 mL Milli-Q 水或去離子水漂洗凝膠脫色，直至達到所需的凝膠背景。每 30 min 換一次水。

3.2 電洗脫

( 1 ) 將電洗脫管垂直向上放置，加入 0.8 ml Milli-Q 水或去離子水，蓋上蓋。等待 10 min 并檢查是否漏液。倒空管內液體（見注釋 4) 。

( 2 ) 用一個干凈，鋒利的直刃剃刀將蛋白質條帶從染色的凝膠上切下來，用一字鑷子將凝膠碎片轉移至電洗脫管中，在管中加入 1X 電泳緩沖液（0.8 ml) ，輕輕蓋上蓋，小心地將管安放在電洗脫儀的支持盤上，這樣電流就可以直接通過兩個薄膜窗（見注釋 5 ) 。

( 3 ) 向電泳槽內灌入 1X 電泳緩沖液并將電洗脫支持盤放入槽內，確保電洗脫管完全浸泡在電泳緩沖液中，而且每根管的薄膜與電場垂直。

( 4 ) 120 V 電泳洗 2 h（見注釋 6) 。

( 5 ) 電泳結束后，翻轉正負極，并在相同電壓下電泳 30~60 s ( 見注釋 7) 。

( 6 ) 用鑷子將凝膠碎片從電洗脫管中取出。輕輕蓋上蓋，將管子放回支持盤中。

( 7 ) 將支持盤放入盛有所需緩沖液或酸化水（1% 蟻酸）的 2 L 燒杯中。4°C 過夜透析，期間更換一次緩沖液。

( 8 ) 透析完成后，將蛋白質溶液轉移至 1.5 mL 微量離心管中，用真空離心濃縮儀 ( SpeedVac) 濃縮至 5 μL 左 右 （見注釋 8) 。

( 9 ) 將濃縮后的蛋白質溶液（1 μl ) 與基質溶液（1 μl，芥子酸，10 mg/ml 溶于 30% 乙腈）混合在 150 μl 微量離心管中，蓋緊蓋后 4°C 放置過夜，讓蛋白質和基質共結晶（見注釋 9) 。

( 10 ) 輕輕打開微量離心管蓋并用 2 μl 移液器除去上清液。向管中加入 1 μl 基質溶液以重懸晶體，渦旋振蕩，然后將其點樣在 MALDI 樣品板上（見注釋 10)。