實時PCR檢測HSV2DNA的方法學評價及應用

【摘要】  目的 對本室利用Taq Man MG技術建立的HSV-2實時定量PCR法進行方法學評價及臨床應用。 方法 收集60名近期有流產史婦女的全血及血清標本，分別用FQPCR和ELISA法同時檢測，并進行比較；另對FQPCR從重復性、靈敏度、線性范圍、特異性幾方面進行方法學評價。結果 對60份臨床標本檢測，ELISA法的陽性率為16.7%，FQPCR法的陽性率為31.7%，明顯高于前者（P<0.05)。FQPCR法的重復性較好［批內CV(變異系數)值為2.29%，批間CV值為4.76%］、線性范圍好(4.75×101～106 copies/μl，r=0.998)、靈敏度達到47.5copies/μl、特異性較好（對HSV1、Vero細胞、巨細胞病毒、弓形蟲等無特異性擴增）。結論 實時PCR測定HSV2方法比傳統的ELISA法更快速靈敏，是較有發展前途的新技術。

【關鍵詞】  實時定量PCR； 單純皰疹病毒2型； 生殖器皰疹

    【Abstract】  Objective  To evaluate newly established realtime PCR method with Taq Man MG technique and apply it into clinical research Methods   Specimens from 60 women with recent abortion history were collected and detecteol with FQPCR and ELISA methods. FQPCR were evaluated on reproducibility,specificity,linear range and sensitivity. Results  The position rate of FQPCR and ELISA is 31.7% and 16.7% respectively, the former is higher than the latter(P<0.05). The assay showed good reproducibility (intraassay coefficients 2.29％ and interassay coefficients 4.76％)， good linear range (4.75×1014.75×106 copies／μl，r=0.998) ，good specificity(distinguishing HSV2 from other pathogenic microorganism) and sensitivity of 47.5 copies／μ1. Conclusion  FQPCR for detecting HSV2 is more sensitive, faster than ELISA and is a promising technique.

    【Key words】  rea1time PCR； HSV-2； genital herpes

    單純皰疹病毒2型（herpes simplex virus,HSV-2）是引起生殖器皰疹（genital herpes,GH）的主要病原體，GH具有長期潛伏性、無法徹底治愈、病情反復發作等特點。孕婦GH還可引起胎兒宮內感染或新生兒感染，導致流產、早產、先天畸形、新生兒死亡或發生嚴重后遺癥［1］。近年來，GH的發病率不斷上升，其中部分表現不典型，甚至無癥狀，而及時準確地對這類感染者診斷并采取相應的防治措施可有效降低感染率［2］。

    感度不高、耗時較長等缺點。而實時熒光PCR（realtime PCR）是近幾年發展較為迅速的新技術，具有高敏感性、高特異性和高精確性等優點。本實驗室在前期利用Taq Man MGB技術，建立一種檢測HSV2的實時定量PCR，現對該方法進行臨床應用及方法學評價，結果報告如下。

    1  材料和方法

    1.1  主要儀器及試劑

    ELISA定量酶標儀Model550 BIORAD(美國)；實時定量PCR儀RG3000(澳大利亞)；實時PCR法定量標準品實驗室自制；HSV-2 IgM ELISA KIT晶美生物；引物及探針上海基康公司設計并合成；HSV-2　SAV株購自中國疾病預防控制中心病毒研究所。

    1.2  標本

    從2004年1月至2004年6月，以廣東省各大醫院就診的近期有流產史60名婦女作為研究對象，收集全血及血清兩類標本，并置于-20℃保存備用。

   1.3  方法

    1.3.1  抗HSV2檢測  對60例受檢對象的血清樣本作為樣本，完全按照試劑盒說明書操作。

    1.3.2  HSV2的FQPCR定量檢測  分別提取60例受檢對象的全血樣本DNA，用本實驗室建立的實時PCR對HSV-2檢測。引物及探針根據gG基因片段由上海基康公司設計并合成，分別是：FP:5′CCCCTGTTCTGGTTCCTAACG3′，RP:5′GTGGATGGTGGTGCTGATGATA3′，FAM:5′CCTGCTCTAGATATCCT 3′。實時定量PCR反應體系總體積30 μl,分別是模板DNA：2.0 μl；上游引物(5 μm)：3.6 μl；下游引物 (5 μm)：3.6 μl；熒光探針(10 mm)：0.9 ml；dNTP mixture(10 mm)：2.4 ml；Taq DNA聚合酶：0.2 ml；10×PCR Buffer：3.0 ml；MgCl2(25 mm)：6.0 ml；ddH2O：8.3 ml。反應條件：95℃ 5 min；94℃ 15 s，60℃ 60 s，30個循環。

    1.3.3  重復性  包括批內和批間重復性，批內重復性是一次對HSV-2標準毒株重復檢測10次，根據測得的Ct值計算標準差(s)和CV值；批間重復性是連續10 d對同一樣本進行檢測，根據測得的Ct值計算s和CV值。

    1.3.4  線性范圍  將標準品進行系列10倍稀釋，得到4.75～4.75×108copies／μl 9個濃度。分別以每個濃度的標準品作模板進行熒光定量PCR檢測，對所得熒光擴增曲線進行軟件處理得到標準曲線。根據r>0.99的原則，判斷方法的線性范圍。

    1.3.5  靈敏度  取已制得的標準品10 μl用雙蒸水稀釋100倍，分別測得其在260 nm和280 nm處的吸光度，根據A260／A280判斷其純度并求得濃度為4.75×108copies／μl，再對其進行l0倍梯度稀釋至4.75　copies／μl將標準品按l0倍梯度稀釋至4.75 copies／μl，以每個濃度的標準品作模板進行熒光定量PCR檢測，以出現典型的擴增曲線的最低病毒DNA濃度為該法的最低檢測限。

    1.3.6  特異性  對HSV-2進行實時熒光定量分析，同時設定非靶DNA對照(Vero細胞、HSV-1、弓形蟲、巨細胞病毒)。

2  結果　

    2.1  臨床標本檢測結果

    60例孕婦標本經ELISA及實時定量PCR方法檢測，結果見表1。血清標本ELISA檢測出10例HSV-2 IgM抗體陽性標本，陽性率為16.7％(10／60)，而實時定量PCR檢測出HSV-2 DNA陽性標本有l9例，其陽性率為31.7％(19／60)。表1  ELISA與Realtime PCR檢測HSV-2結果比較(略)

    2.2  重復性

    對同一標準品進行了批內及批間重復性測定，結果為：批內平均值為5.41，CV值為2.29％；批間平均值為5.46，CV值為4.76％。建立實時定量PCR檢測方法具有較好的重復性。圖1是批內重復性結果。

    2.3  線性范圍

    標準品的濃度在4.75×101～4.75×106 copies／μl之間，標準曲線有良好的相關性(r=0.998)，見圖2.

    2.4  靈敏度

    當標準品的濃度低至4.75　copies／μl時，實時定量PCR檢測結果不穩定，而標準品的濃度在4.75×101～4.75×106copies／μl時，可穩定地得到擴增曲線，因此最終確定該方法的靈敏度為47.5　copies／μl。

    2.5  特異性

    實時熒光定量分析顯示非靶模板的反應孔無熒光信號出現，而HSV-2呈陽性反應，表明該方法有良好的特異性。

    3  討論　

    目前，國內應用最廣泛、最成熟的實時定量PCR技術是TaqMan技術，而本實驗室建立的HSV-2實時定量PCR法采用的是改良的TaqMan技術，即TaqMan MGB技術［3］。與前者相比它有兩個主要的優點［2］：①探針3′ 端標記了自身不發光的淬滅熒光分子, 使熒光本底降低，熒光光譜分辨率得以大大改善，靈敏度更高。②探針3′端另外結合了MGB基團，使得探針的Tm值提高，大大增加了探針的雜交穩定性。同時也加大目標模板和非特異性帶Tm值差異，特異性更高。因此本實驗室采用TaqMan MGB技術建立HSV2實時定量PCR法。對本實驗室建立方法的方法學評價結果顯示：重復性較好，批內CV值是2.29%，批間CV值是4.76%；特異性好，只對HSV-2有特異性擴增，對HSV-1、Vero細胞、弓形蟲、巨細胞病毒無擴增；線性范圍好：從101到106數量級的模板都有較好相關性，r＝0.998.

    目前，臨床上對該病的主要檢測方法是血清學方法，對IgM抗體的檢測可以反映近期是否感染，但該法存在以下缺點：病人從感染到體內IgM抗體的產生這段時間被稱為“窗口期”，對這一時期的病人檢測體內IgM抗體會出現假陰性結果；血清學檢測是反映人體對HSV-2的免疫狀態，只能間接反映體內是否存在病原體，不能真實反映感染的嚴重程度。而實時定量PCR是直接對體內病原體DNA檢測，可真實地反映是否發生感染和病情的嚴重程度。在本研究中對這兩種方法進行了比較，結果顯示：ELISA法的陽性率為16.7%，實時定量PCR法的陽性率為31.7%，明顯高于前者（P<0.05)。在實時定量PCR法檢測為陽性的10例標本用ELISA法檢測為陰性結果，這可能是由于體機雖已感染了HSV-2，但仍處于“窗口期”，因此血清學檢測為陰性結果。為了早期反映機體的感染情況，實時定量PCR法更優于ELISA法。

    總的來說，本實驗室建立HSV2實時定量PCR方法是較為成功的，與傳統的ELISA法相比敏感性更高，更有利于HSV2感染的早期診斷。

【參考文獻】
［1］Jonsson MK，Wahren B．Sexually Transmitted Herpes Simplex Viruses ［J］.Stand J Infect Dis，2004，36(2)：93101．
［2］Freij BJ．Management of Neonatal Herpes Simplex Virus Infection ［J］.Indian J Pediatr，2004，71(10)：921926．
［3］Kntyavin IV，Afonina IA，Mills，et al. 3′minor Groove BinderDNA Probes Increase Sequence Specificity at PCR Extension Temperatures［J］．Nucleic Acid Res，2000，28(2)：655661．