本文介紹了由 Zoller 和 Smith 的雙引物技術（1984,1987) 結合 Kunkel 的誘變體產量富集方法（1985) 構成的經典方案。本方案中使用的單鏈 DNA 模板含有較高的尿嘧啶殘基，因為它們是從生長于 dut 和 ung 基因突變大腸菌中的 M13 噬菌體中制備的（見方案 1)。本實驗來源于分子克隆實驗指南（第三版）下冊，作者：〔美〕J. 薩姆布魯克 D.W. 拉塞爾。
| 實驗材料 | 適用于轉化的大腸桿菌菌株用于轉化的大腸桿菌 TG1 感受態菌 |
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| 試劑、試劑盒 | ATPPE1緩沖液PE2 緩沖液噬菌體 T4 DNA 連接酶噬菌體 T4 多核苷酸激酶大腸桿菌 DNA 聚合酶ⅠKlenow 片段M13 噬菌體通用測序引物含 4 種 dNTP 的 dNTP 溶液誘變的 M13 噬菌體單鏈 DNA 模扳誘變的寡核苷酸引物培養液2XYT 頂層瓊脂平板和 YT 瓊脂平板 |
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| 儀器、耗材 | Falcon2059 試管（預冷）或電擊杯47°C 加熱塊或水浴16°C、42°C 和 68°C 水浴適合變性溫度的水浴 |
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| 實驗步驟 | 材料
緩沖液和溶液
各種貯存液，緩沖液和試劑成分請參閱附錄 1。
將貯存液稀釋至所需的濃度。
ATP(10 mmol/L)
10xPE1緩沖液
200 mmol/L Tris-Cl(pH7.5)
100 mmol/L MgCl2
500 mmol/L NaCl
10 mmol/L DTT
10XPE2 緩沖液
200 mmnl/L Tris-Cl(pH7.5)
100 mmol/L MgCl2
100 mmol/L DTT
酶和緩沖液
噬菌體 T4DNA 連接酶
噬菌體 T4 多核苷酸激酶
大腸桿菌 DNA 聚合酶ⅠKlenow 片段
延伸反應可使用任意一種 DNA 聚合酶（步驟 4 和 5)。Klenow 片段缺乏 5'端外切核酸酶活性，因此不能降解模板。然而, 其他酶例如噬菌體 T4DNA 聚合酶 (Nossal 1974,Geisselsoder et al.1987); 天然的 T7DNA 聚合酶（Bebenek and Kunkel 1989) 以及測序酶 Schena 1989,Venkitaiaman l989) 薄要較短的孵育時間。當磷酸化的誘變寡核苷酸被用做聚合反應或延伸反應單一引物時必須使用這些酶。不像 Klenow 片段，無論測序酶或天然的由噬菌體 T4 和 T7 編碼的 DNA 聚合酶都不能從模板上置換誘變寡核苷酸（Nossal 1974，Kunkel 1985，Bebenek and Kunkel 1989，Schena 1989)。
核酸和寡核苷酸
M13 噬菌體通用測序引物
任何商業化的以 M13 單鏈噬菌體正鏈為模板用于引導 DNA 雙脫氧測序反應的通用引物均適用于本方法。
含 4 種 dNTP 的 dNTP 溶液，每一種 dNTP 的濃度為 2 mmol/L。
使用高質量的 dNTP 以降低污染的 dUTP 摻入到 DNA 新合成鏈中的幾率。我們認為 Pharmacia 公司生產的濃縮 dNTP 溶液效果良好。
誘變的 M13 噬菌體單鏈 DNA 模扳
誘變的寡核苷酸引物
應按照信息欄關于誘變寡核苷酸專題的所述設計誘變寡核苷酸。在定點誘變前用 Sep-Pak C18 柱屋析純化誘變寡梭苷酸去除鹽和其他雜質（請見第 10 章方案 6)。除非寒核苷酸長度超過 30 個梭苷酸或將被用于環入或去環誘變，否則不需要用聚丙烯酰胺凝膠電泳純化寡核苷酸。
培養液
2XYT 頂層瓊脂平板和 YT 瓊脂平板
專用設備
Falcon2059 試管（預冷）或電擊杯
47°C 加熱塊或水浴
16°C、42°C 和 68°C 水浴
適合變性溫度的水浴，
請見步驟 3, 熱循環儀亦可用于上述步驟中。
其他試劑
步驟 1 所需要的試劑列在本章方案 1 中。
步驟 7 所需要的試劑列在第 12 章方案 3 和 4 中。
步驟 7 所需要的試劑列在本章方案 7 中。
載體和菌株
請見附錄 3
適用于轉化的大腸桿菌菌株（例如，TG1)
用于轉化的大腸桿菌 TG1 感受態菌。
感受態細胞制備見第 1 章方某 25 和 26。
大腸桿菌菌株 TG1 過夜培養物
方法
1. 按方案 1 所描述的方法制備 M13 噬菌體單鏈模板。用離心柱層析純化含尿嘧啶的模板。
2. 用噬菌體 T4 多核苷酸激酶對誘變體寡核苷酸和通用測序引物進行磷酸化，在不同的微量離心管中混合下列物質：
合成的寡核苷酸 100~200pmoles
10X 噬菌體 T4 多核苷酸激酶緩沖液 2ul
10 mmol/LATP 1ul
噬菌體 T4 多核苷酸激酶 4 單位
加水至 20ul
37°C 孵育反應 1 h, 然后 68°C 加熱 10 min 滅活多核苷酸激酶。
3. 將磷酸化的誘變寡核苷酸和通用測序引物與含靶序列的單鏈 M13 噬菌體 DNA 復性。混合下列反應物：
單鏈模板 DNA(-1ug) 0.5pmole
磷酸化的誘變寡核苷酸 10pmoles
磷酸化的通用引物 10pmoles
10XPF11 緩沖液 1ul
加水至 10ul
在高于誘變寡核苷酸完全雜交的理論 Tm 值 20°C 以上的溫度加熱上述混合物 5 min, 計算 Tm 值的公式為：Tm=4(G+C)+2(A+T),(G+C) 是寡核音酸中 G 和 C 殘基的總和，（A+T) 是寡核苷酸中 A 和 T 殘基的總和。將含有反應混合物的離心管轉移至一個裝有水的而且水溫高于 Tm 值 20°C 以上的燒杯中。將燒杯放置在工作臺上，待其緩慢冷卻至室溫（~20 min)。在微型離心機上稍微離心（5s) 收集所有的管壁上的冷凝液。
或者，加熱或冷卻核酸和寡核苷酸的操作可在熱循環儀中進行。引物對模板的摩爾濃度比應為 10:1 或 50:1 使用過多的引物將增加靶 DNA 的異位突變頻率。
4. 當退火反應冷卻到室溫時，將下列試劑混合在一新的 0.5 ml 的微量離心管中。
10 X PE2 緩沖液 1.0ul
2 mmol/L dNTP 溶液 1.0ul
10 mmol/L ATP 1.0ul
噬菌體 T4DNA 連接酶 5Weiss 單位
Klenow 片段 2.5 單位
將上述混合物置于冰上備用。
當使用噬菌體 T4DNA 聚合酶或測序酶時，在 0°C 孵育聚合/延伸反應（步驟 5)5 min，室溫孵 5 min, 然后在 37°C 孵育 2 h。低溫孵育有利于合成從 3'端 DNA 起始，后來在 37°C 孵育可提高延伸反應的效率。另外，應將反應中 4 種 dNTP 每一種的濃度增加至 500umol/L。這將顯著增加延伸反應效率，并強烈抑制噬菌體 T4DNA 聚合酶的 3'端外切核酸酶活性。
5. 把 10ul 冰冷的步驟 4 反應混合物加入到含單鏈 DNA 和退火的寡核苷酸的混合物中 (步驟 3)。16°C 孵育該最終反應混合物 6~15 h。
6. 按以下步驟轉染合適的感受態大腸桿菌宿主菌（例如 TG1)
a. 用 10 mmol/LTris-Cl(pH7.6) 對反應混合物進行系列稀釋（1:10,1:100,1:500)。
b. 準備一系列預冷的（0°C)Falcon2059 離心管，(i) 分別把 1ul、5ul 原始反應混合物和（ii)1ul、5ul 各種稀釋度的反應混合物轉移到離心管中。每個離心管中加入 200ul 感受態 TG1 細胞制備物。
c. 將上述混合溶液置于冰上 30 min, 再轉移到 42°C 水浴中準確保溫 2 min。
d. 從 42°C 水浴中取出反應物，加入 100ulTGl 過夜培養細胞。加入過量的細胞更易觀察在菌苔中生長的 M13 噬菌斑。
如果步驟 b 中使用新制備的 TG1 細胞而不是冷凍的感受態細胞則不需要額外加入 TG1 細胞。
e. 每只離心管中加入 2.5 ml2xYT 頂層瓊脂（融化并冷卻至 47°C), 混合后鋪在 YT 瓊脂平板頂層。37°C 孵育平板 12~16 h 待噬菌斑形成。
也可以用電擊法把突變的 DNA 導入大腸桿菌。電擊法的轉染頻率通常比正常轉染方法髙出許多，因此在電擊前應將每份誘變反應混合物用水進行 1/100;1/500;1/1000 和 1/10000 倍系列稀釋. 分別取 1~10ul 稀釋液進行電擊。
7. 通過對單鏈噬菌體 DNA 測序方法篩選噬菌斑（請見第 12 章方案 3 和 4)。如需要, 可通過放射性同位素標記的寡核苷酸探針篩選低頻率出現的突變體。
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