小膠質細胞原代培養實驗

新生1-3d的仔鼠

含10%胎牛血清的DMEM培養基 D-PBS液 消化液(0.25%胰蛋白酶+0.04%的EDTA)

37℃恒溫搖床

1按照培養少突膠質細胞的方法，待10d后細胞分層生長。顯微鏡下可見滿視野圓形、折光性強的小膠質細胞，附著在貼壁生長、緊密連接在一起、鋪滿培養瓶的星形膠質細胞層上面，甚至可見許多圓形小膠質細胞飄落在培養液中，此時可以開始純化。

2.將培養瓶固定到37℃恒溫搖床上，80-200r/min,振搖2h左右。

3收集振搖下來的小膠質細胞，種植到多聚賴氨酸包被的培養皿中，加入新的含10%胎牛血清的DMEM培養基繼續培養，每2-3d換液1次。

4.小膠質細胞在體外較難進一步分裂增殖，但如果根據實驗需要傳代培養，一種方法可以直接用細胞刮子刮下細胞，接種到新的培養皿中；另一種方法就是用0.25%胰酶+0.04%的EDTA消化后，進行傳代。此方法獲得的小膠質細胞，純度可達90%-95%以上，可以用小膠質細胞特異性標志物F4/80、IBA1和IB4等進行免疫細胞化學染色進行鑒定。相差顯微鏡下觀察，靜息狀態的小膠質細胞形態呈短小桿狀或細長梭形等形態，帶有2個或以上突起，折光性強，但是在激活和發揮吞噬功能狀態下，小膠質細胞形態可發生巨大變化，胞體變大、變長或者變圓（圖I--5)。

1.所有步驟要無菌操作．否則小膠質細胞有被污染或被微生物及毒素激活的可能。

2在振搖細胞之前，一定要確保底層的星形膠質細胞鋪滿培養瓶，并緊密連在一起，否則振搖過程中會將星形膠質細胞層搖起。

1.振搖分離出小膠質細胞后，將新的培養液加入原培養瓶中繼續培養，數天后又會出現大量的小膠質細胞，如此可以重復甚至更多次振搖收集小膠質細胞。

2.由于小膠質細胞數目所占比例較小，在體外較難分裂增殖，故其產最不高。有文獻報道可以采用營養缺失法或加入單核細胞集落刺激因子(M-CSF)以增加產量。作者在培養過程中加入了15%-30%L929條件性培養基。L929是一種成纖維細胞系，由于其分泌M-CSF,結果可獲得充足的小膠質細胞。