小鼠單個核細胞的分離實驗

基 本 方 案 從 脾 臟 、胸腺和淋巴結制備細胞懸液

材 料

RPMI-5 或 DMEM-5 完全培養基

新鮮分離的小鼠器官： < 6 周齡的小鼠胸腺； 6 周 至 6 個月齡的小鼠脾臟和淋巴結

60 mmX 15 mm 培養皿

剪 刀 和 鑷 子（保 存 在 7 0 % 乙醇的燒杯中）

裝 有 19 G 針 頭 的 6 ml 注射器

200um 尼龍濾網

1 . 將新鮮分離的器官放入盛有 3 ml RPMI-5 或 DMEM-5 完 全 培 養 基 的 60 mm X15 mm培 養 皿（每種器官一個培養皿）中，用剪刀將器官剪碎。

2 . 用 6m l 注射器的活塞將組織塊向培養皿底面用力擠壓直到僅剩纖維組織。

3 . 用 裝 有 19 G 針 頭 的 6 ml 注射器將組織懸液反復抽吸數次，以進一步粉碎組織團塊。

4 . 將細胞懸液通過 200 Mm 尼龍濾網濾入離心管中。用 約 4m l 完全培養基洗一次培養皿 ，如需要則重復一次，之后將洗液通過濾網加入離心管中。

5.在 Sorvall H-1000B 離心機中以 lOOOr/min (200 g) 離 心 IOmin 后 棄 上 清（如需要去除紅細胞和死細胞，見輔助方案）。用 20m l 完全培養基將沉淀重懸后離心，再以適量培養基重懸以便計數（附 錄 3A)。

6 . 如細胞不能立即處理，最好的保持細胞活力的辦法是將細胞懸液置于冰塊中。這種處理也能減少因細胞貼壁引起的細胞損失（單 元 2. 3)。

輔 助 方 案 1 去除脾臟細胞懸液中的紅細胞

脾臟細胞懸液在進行淋巴細胞計數之前最好先去除紅細胞（RBC)。胸腺和淋巴結細胞懸液則不必去除紅細胞。脾臟細胞的亞群分離也需先去除紅細胞。

附 加 材 料（其他材料見基本方案，帶 V 項 目 見 附 錄 1)

V A C K 裂解緩沖液

1 . 每個脾臟用約 5 ml 裂解緩沖液懸浮脾臟細胞；一 個 12 ml 試管可用于裂解一個或兩個脾臟 ，也可以用 50 ml 離心管裂解更多的脾臟。

2 . 室溫孵育 5 min，間以搖動。

3 . 加入洗液直 至 裝 滿 容 器 ，在 低 速 離 心 機 上 以 200 g 離 心 IOmin 后 棄 上 清 。再洗沉淀 一 次 并 以 適 量 培 養 基 重 懸 以 便 下 一 步 操 作（如 去 除 死 細 胞 、細胞計數或者細
胞分 離）。輔 助 方 案 2 —步梯度法去除死細胞下面介紹的方法，其基本原理是基于活細胞（密度較小）和 死 細 胞（密度較大）密度不同，從而有助于將活的淋巴細胞與紅細胞分離。

附加材料

高密度溶液： Ficoll-Paque (Ficoll 和 泛 影 酸 納 ； Pharmacia LKB) 或 Lympholyte——M(Cedarlane)
12m l 或 50m l 聚 丙 烯 離 心 管（比聚苯乙烯離心管好）

注 ： Flcoll-Paque 和 Lympholyte-M 的密度與溫度有關；該方法中所釆用的以及其他商品化的高密度溶液適合在室溫中使用。因此應注意使細胞懸液、離心和高密度溶液控制在室溫。否則會因活細胞沉入離心管底導致在密度界面上損失活細胞。