小鼠神經干細胞的分離

實驗概要

小鼠神經干細胞的分離

主要試劑

0.05% Trpsin、神經干細胞的分離溶液Ⅰ、神經干細胞的分離溶液II、神經干細胞的分離溶液III、神經干細胞培養液

主要設備

15 mL、50 mL離心管，10%FBS包被的玻璃巴斯德管，70 μm細胞濾膜，4℃低溫離心機

實驗步驟

（1）用10%FBS（vol/vol，DPBS配制）浸泡處理玻璃巴斯德管十分鐘。把室管膜下區組織轉移至15 mL離心管中，加入5 mL試劑I，用10%FBS包被的玻璃巴斯德管反復吹吸十余次將組織吹散。
！注意：吹吸組織過程中應避免產生氣泡，以防止細胞生存能力降低。此步驟只適用于最多6只小鼠的組織制備。
（2）樣品中加入100 μl 0.05%Tripsin，37℃溫育15 min，然后用FBS包被的巴斯德管研磨十次左右，再次37℃溫育15 min，再研磨十次。
！注意：一定要將組織充分消化為單細胞，否則較大的組織會被接下來的過濾操作去掉，這會導致細胞大量損失。
（3）加5 mL冰上預冷的溶液Ⅲ，用移液槍上下混勻。溶液Ⅲ中的BSA可以終止Tripsin的作用。
（4）將一個70 μm細胞濾膜放置在50 mL離心管上，然后將所有溶液通過細胞濾膜以去除殘留的細胞團塊，再將濾過的溶液轉移至一個15 mL離心管中。4℃條件下180 g離心5 min。
（5）小心去除上清，向細胞中加入10 mL冰上預冷的溶液Ⅱ，上下吹打混勻。4℃條件下510 g離心20 min。
（6）小心去除上清，向細胞中加入2 mL冰上預冷的溶液Ⅲ。準備一個盛有12 mL冰上預冷的溶液Ⅲ的15 mL離心管，然后將2 mL細胞懸液加到上述離心管液面上。4℃條件下290 g離心12 min。