小鼠肝組織DNA的提取

實驗概要

掌握從動物組織中提取DNA的基本原理和方法，了解利用電泳技術分離、鑒定核酸的原理和方法。

實驗原理

真核生物DNA主要以核蛋白形式存在于細胞核中，因此制備DNA必須先粉碎組織，裂解細胞膜和核膜，使核蛋白釋放，在除去蛋白質、脂類、糖類和   RNA等物質，得到純化的DNA。在本實驗的提取DNA反應體系中，SDS（十二烷基磺酸鈉）破壞細胞膜和核膜，并使蛋白質變性，將核蛋白中的DNA與蛋白質分開，EDTA及SDS抑制細胞中的DNA酶的活性。用酚、氯仿抽提的方法進一步除去蛋白質，得到的DNA溶液經乙醇沉淀除凈小分子化合物。提取出的  DNA制品進一步用含溴乙錠的瓊脂糖凝膠電泳加以鑒定。

主要試劑

1. 生理鹽水

2. 裂解緩沖液

3. 苯酚：氯仿混合液（1：1）

4. 無水乙醇

5. 70％乙醇

6. TE緩沖液

7. 溴酚藍載樣液

8. 溴乙錠溶液

9. TBE緩沖液

主要設備

1. 研缽

2. 研缽棒

3. 刻度離心管

4. 普通離心機

5. 小試管

6. Ep管

實驗材料

小鼠

實驗步驟

1. 處死小鼠，迅速取出小鼠肝臟，用生理鹽水洗去附著血液，用濾紙吸干血水后稱量0.5g肝實質組織放于研缽中。

2. 研缽中加入1ml裂解緩沖液、少量石英砂，研磨至勻漿，再加入2ml繼續研磨至勻漿。

3. 取刻度離心管一支，加肝勻漿至1.0ml，再加入等體積苯酚：氯仿混合液抽提，每次抽提以中等大小的力來回振蕩5min，然后離心 3000r/min，10min，水相吸入另一干凈的小試管中，抽提重復3次。

4. 往乘有上水相的小試管中加入2.5倍體積的冷無水乙醇，輕輕混勻，此時可見有白色絮狀沉淀，此即DNA粗制品。

5. 將試管中的上清液倒出，保留沉淀。用70％的乙醇洗滌沉淀2次，洗滌時動作要輕柔，同上法棄上清保留沉淀。

6. 加入0.25mlTE緩沖液溶解沉淀。

7. 取30ml沉淀溶解液放入Ep管中。

8. 向Ep管中加入溴酚藍載樣液5ml，混勻后即為鑒定所用樣品。

9. 取瓊脂糖0.3g，TBE緩沖液15ml加入錐形瓶中，加熱錐形瓶使瓊脂糖充分熔解后，加入10ml溴乙錠，混勻后將膠液倒入已放置樣孔梳的膠板上。

10. 待膠板凝好后拔去樣孔梳，取15ml樣品液加入樣孔槽中。

11. 將加好樣品液的膠板放入乘有TBE緩沖液的電泳槽中，樣孔槽位于陰極側，蓋好電泳槽蓋后通電，調節電壓100V電泳40-60min。

12. 泳畢，拿出膠板，在紫外光燈下觀察結果。

注意事項

1. 吸水相時不要將界面上的變性蛋白質混入，抽提3次后一般有機相和水相界面上的變性蛋白質極少，肉眼基本看不見，若變性蛋白質仍較多，可增加抽提次數。實驗中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并燒成鈍口。

2. 最后一次棄上清時，盡可能去盡上清。