小鼠胚成纖維細胞的培養和體外分化

母鼠

PBS 胰蛋白酶溶液 DNase 溶液

無菌解剖器械 不銹鋼濾網 燒瓶 培養箱

1. 準備下列試劑和材料：

確定懷孕期的母鼠（孕期14至6天）

無菌解剖器械（鑷子、剪刀、手術刀片）

Cellector 帶收集裝置的不銹鋼濾網，1 mm 直徑篩網

內有攪拌棒的 125 ml 無菌的胰蛋白酶消化的燒瓶

有攪拌盤的培養箱

無 Ca²⁺ 和 Mg²⁺ 的 PBS

胰蛋白酶溶液

DNase 溶液（10 mg/ml）

MEF 生長培養基

MEF 凍存培養基

150 mm 和 100 mm 組織培養皿

2 ml 冷凍管

2. 殺死懷孕 14~16 天的母鼠，取出子宮，放在盛有 PBS 的 100 mm 組織培養皿中，取出胚胎，去胚胎外組織，PBS 沖洗去血。

3. 用無菌鑷子去胚胎頭和內臟。

4. 胚胎轉移到盛有 40 ml PBS 的 50 ml 無菌離心管中，輕輕顛倒兩次。小心倒掉 PBS，再加 40 ml PBS 清洗。倒掉 PBS，留 10 ml 將胚胎轉移到 100 mm 培養皿。

5. 手術刀片細細切碎胚胎，用鑷子擠壓使其通過無菌濾網。15 ml 胰酶溶液沖洗濾網兩次，解剖胚胎混合物轉移至 125 ml 胰酶消化的燒瓶。加 400 μl DNase 粗品，以免釋放出的 DNA 導致溶液過黏。

6. 濕潤的 5% CO₂ 溫箱中 37℃ 輕輕攪動孵育 30 分鐘。

7. 由燒瓶側臂把上層細胞懸液倒入一裝有 10 ml MEF 生長培養基的 50 ml 離心管。

8. 離心收集細胞。

9. 30 ml MEF 生長培養基洗兩次。

10. 細胞懸于 15 ml 生長培養基，用血細胞計數可存活有核細胞（非血紅細胞或碎片）。10 只 15 天幼鼠可獲得 5X10⁷ 到 1X10⁸ 細胞。

11. 6X10⁶ 細胞懸于 25 ml MEF 生長培養基，接種一塊 150 mm 培養皿（總計接種 10~15 塊）。

12. 24 小時后更換新鮮 MEF 生長培養基。

13. 約 2~4 天后細胞長滿，1:5 傳代。分 8 批操作，15 ml PBS 沖洗，倒掉，加 10 ml 胰酶溶液，37℃ 孵育 5 分鐘。

14. 每塊胰酶消化的細胞板加 10 ml 生長培養基，輕柔吹吸，分散細胞，轉移到 50 ml 離心管，兩塊板的細胞合并到一管中。

15. 離心收集細胞。細胞懸于培養基中，1:5 分加到 150 mm 培養皿。

16. 約 3 天后細胞長滿，可以收獲凍存于液氮中。分 8 批操作，15 ml PBS 沖洗，倒掉，加 10 ml 胰酶，37℃ 孵育 5 分鐘。

17. 加 10 ml MEF 生長培養基，輕柔吹吸，分散細胞，轉移到 50 ml 離心管。

18. 離心收集細胞。每塊培養皿收獲的細胞懸于 2 ml 凍存培養基。

19. 每支冷凍管加 1 ml 細胞，旋緊蓋子，-80℃ 冰箱過夜。此步操作需迅速。

20. 第二天將細胞轉移至液氮中。轉移過程中需放在干冰上避免升溫。