小鼠胚胎干細胞培養實驗步驟（一）

一般培養-保持胚胎干細胞處于未分化狀態
培養基
細胞復蘇
凍存細胞
明膠包被
細胞傳代

體外分化
培養基
包被有多聚鳥氨酸/纖維結合蛋白的培養板（使用或不使用蓋玻片）
體外分化方法

注：以下培養針對于小鼠的R1胚胎干細胞系，其它胚胎干細胞的培養可以參考。不過人的胚胎干細胞培養不可以采用下面的protocol，需要用專用的protocol和培養基。

一般培養--維持ES細胞處于未分化狀態
ES細胞培養用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed細胞的培養基（高糖）來阻止細胞的分化。為細胞提供包被有0.1％明膠的平板作為粘附細胞的基質。建議每2－3天從達到80％－90％融合的平板按1：8的比率傳代細胞一次，細胞傳代以后，在將細胞接種在0.1％明膠包被的培養皿之前，通過預先將細胞接種在沒有經過包被的組織培養板2個小時，使分化細胞粘附，從而將分化和未分化細胞分開。將細胞全程置于37℃，5％CO2，100％濕度條件下培養。如果在Feed細胞，那么就需要采用MMC進行處理，抑制Feed細胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暫不提及Feed細胞。Feed細胞可以來源于STO細胞或原代胚胎成纖維細胞。

培養基
ES:
配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（該溶液也能用于EB培養基--見下文）。分裝在50ml 離心管中，（稀釋為2×，每管42ml），貯存在-20℃。通過將21ml該溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制備培養基，0.22 μm濾膜過濾。貯存于4℃，時間不要超過2周。

貯存液          
DMEM(高糖)          
馬血清（HS）          
L-谷氨酰胺（200mM）          
MEM NEAA（10mM）          
HEPES（1M）          
β-巰基乙醇（55Mm）          
PEST          
LIF         

復蘇細胞
細胞被凍存在10％二甲基亞砜（DMSO）中防止結晶的形成，結晶的形成會損害細胞。然而，二甲基亞砜對細胞有毒性，快速的進行細胞復蘇是很重要的。

步驟：
1．從液氮中取出一管細胞；
2．將凍存管置于37℃水浴中2分鐘（或放到管內溶液恰好完全溶解）；
3．將細胞轉移到一15ml Falcon管中；
4．加入5ml ES培養基（用培養基沖洗凍存管）；
5．離心3分鐘；
6．棄上清，用2ml ES培養基重懸細胞，至少吹打10次；
7．接種在明膠包被（見下文）的6孔或6cm組織培養皿；
8．孵育。

凍存細胞
凍存液
90％HS和10％DMSO

步驟：
1．1×PBS洗細胞并留少許PBS在培養皿內；
2．用細胞刮刀收集細胞；
3．將細胞轉入15ml 離心管管內并離心3分鐘；
4．棄去上清并將細胞重懸于冷的凍存液中（10 cm的培養皿用2ml，15cm的培養皿用6－7ml。）
5．分裝于凍存管內，每管1ml；
6．置－80℃過夜，第二天移入液氮。