小鼠胚胎干細胞培養實驗步驟（四）

第3步--ITSFn培養基
在最少量培養基中選擇神經前體細胞
1．在胚狀體接種在組織培養皿一天后將培養基換成ITSFn培養基
2．并非所有胚狀體在這一時期都已經發生粘附，因此在移除培養基時要小心謹慎以使大部分胚狀體留在培養皿內。
3．保持細胞在ITSFn中培養大約10天，根據需要更換培養基--大約每隔一天。
觀察細胞形態，神經樣細胞大約出現在第4到第7天。當神經樣細胞能夠被鑒別時，轉入到第4步。步驟的轉換應該在神經前體細胞出現第一個清晰的標志幾天以后，通常是在第3步的第6到第10天。

第4步－N3培養基＋bFGF
通過將神經前體細胞培養在含有10ng/ml bFGF的培養基中進行擴增。
1.PBS洗滌，加入1-2ml 胰酶
2．37℃孵育5分鐘
3．用4mlEB培養基終止胰酶活性，將細胞轉入錐形管中放置3～5分鐘移出細胞團，將上清移入一新的離心管離心。
4．將細胞重懸于含有bFGF的N3培養基。
5．將細胞接種在包被多聚-L-鳥氨酸/纖維連接蛋白的蓋玻片上（最好將蓋玻片放于24孔培養板或6孔培養板，6孔培養板中每孔放置5個蓋玻片如果是塑料的放置4個，以使最大可能的獲得樣品數量）。24孔板接種3.5×105/孔或6孔板1.7×106/孔。
6．2天后更換培養基

第5步－N3培養基
通過撤除bFGF使神經前體細胞分化
1．細胞被接種在蓋玻片上4天后將培養基換成不含bFGF的N3培養基
2．根據需要換液（大約每隔一天）
3．分化10～15天后固定細胞
移除培養基
PBS洗滌
加入4%福爾馬林
室溫放置30分鐘
PBS洗滌2次
儲存于PBS。長期儲存使用含0.01％疊氮化納的PBS
移植細胞的準備
細胞在胚狀體形成4天以后被移植（相應于體外分化過程中的第2步末細胞被轉種到組織培養板）。正如在前文體外分化中所描述的在移植之前4天開始形成胚狀體。通常再需要一天時間以便將胚狀體移植入一10cm的培養皿。

移植
1．將胚狀體轉移至一15ml 圓錐形管中放置3～5分鐘使胚狀體沉降下來。
細胞被離心3分鐘會更好。放置使之沉降將會去除更多的單個細胞（包括死細胞）而這些細胞可以被離心下來。
2．去除上清將胚狀體重懸于無鈣鎂離子的1×PBS中
3．離心3分鐘
4．去除上清加入1×胰酶（10cm的培養皿加1ml）
5．37℃水浴5分鐘
6．加入5mlEB培養基小心吹打約10次
小心處理細胞很重要，進行細胞傳代分散細胞時不可劇烈吹打。
7．離心2分鐘
8．吸出上清將細胞重懸于500μl EB培養基
9．用光滑的巴斯德吸管小心吹打5次
10．離心2次
11．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養基

煙酸己可堿標記ES細胞進行移植
1．準備一10μg/ml的煙酸已可堿染液（雙苯酰亞胺，在冷凍室118）
2．加入1mg（你能稱到的最小量）到5ml EB培養基（制成200μg/ml）
3．將溶液稀釋成10μg/ml （100μl 200μg/ml 溶液和1.9ml EB培養基）
4．如前所述將細胞重懸于2ml煙酸已可堿染液而不是EB培養基中制備ES細胞懸液，
5．將懸液置于室溫（或冰上）30分鐘
6．離心2分鐘
7．吸出上清將細胞重懸于2ml EB培養基
8．重復一次
9．離心2分鐘
10．吸出上清將細胞重懸于100μl EB培養基并置于冰上。