小鼠巨噬細胞的表型檢測

基 本 方 案 直 標 法 檢 測 小 鼠 巨 噬 細 胞 的 表 型

材料

Sorvall RT 6000B 離心機
I . 準 備 4 只 12m m X 75m m 試管，將試管編號為 1?4。每 管 中 加 入 2 X IO⁷個細胞/ml細胞懸液 50ul。

2.每管加入 3 mg/ml 阻斷 I g G 4ul， 4°C 孵育 lOmin。

3 . 按 表 6. 2. 2 所示 ，在 1 號 和 2 號管中加入適量的生物素偶聯的單抗，然 后 將 1 號 、 2號 和 3 號試管冰浴 15 min。

4 . 在 4 號管中加人 5M1 E M A ，混勻。將 試 管 置 白 熾 燈（如 40W 白熾燈）18c m 遠 處 ，室 溫 lOmin。E M A 只 能 進 入 死 細 胞 。 利 用 死 細 胞 的 強 染 色 性 ， 在 F L l 和 F L 3 雙 變 量 散 點 圖上 可 與 活 細 胞 相 區 分 。

5 . 每管加入 3m lPBS， 1500 g 離 心 3 min。 迅速倒掉上清，試管直立后，手指輕彈管底，使細胞沉淀變松。在 1 號管中加入 F IT C 標記的鏈親和素； 2 號管中則加入 T C 標記的鏈親和素。然后將 4 只試管冰浴 lOmin， 其 中 3 號管和 4 號管的細胞彈松即可，不需補加液體。

6 . 樣 品 含 紅 細 胞 時（如新鮮分離的骨髓細胞或脾細胞），每管需加入 3 m l A C K 裂解液；不含紅細胞的樣品，每管加入 3m l P B S 。

7 . 蓋緊試管蓋，顛倒試管 1?2 次 ，混勻細胞后，室溫靜置 3 min。

8 . 室溫， 1500&離 心 4 min，迅速倒掉上清，試管直立后，輕彈管底使細胞沉淀變松。

9 . 加 入 3 ml PBS 洗滌細胞，方法參見步驟 7 和 8 。

10a 直接檢測時：加入 20()/^?83，混勻細胞， 4 ℃ 避 光 待 檢（可保存<4h)。

IOb 固定后檢測時：每管加人 IOOpJ 2 % 甲醛，混勻，加蓋， 4°C 避光，固定 Ih 后待檢。甲 醛 會 改 變 細 胞 的 光 散 射 值 。

II. 用流式細胞儀進行檢測，然 后 用 F A C S c a n 分 析 結 果（第四章）

備 選 方 案 間 標 法 檢 測 小 鼠 巨 噬 細 胞 的 表 型

附 加 材 料

4 . 每管加入 4ul 濃 度 為 3m g /m l 的正常小鼠血清 IgG。冰 浴 lOmin，以阻斷二抗上非特異結合位點。

5 . 每管加入適量熒光素標記的抗 F (ab)[片段二抗。混 勻 ，冰 浴 15 min。

6 . 按基本方案步驟 9 洗滌細胞。

7 . 可選操作：細胞不經洗滌，直接在待測管和 A 管中加入適量的第二種熒光素標記的二抗。 B 管中加入等量的熒光素標記的小鼠 IgG， 用以檢測步驟 6 的阻斷效果。

8 . 余 下 步 驟參見基本方案步驟 9?11