層析技術

層析技術概述

引言

層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），它是在1903~1906年由俄國植物學家M. Tswett首先提出來的。他將葉綠素的石油醚溶液通過CaCO3管柱，并繼續以石油醚淋洗，由于CaCO3對葉綠素中各種色素的吸附能力不同，色素被逐漸分離，在管柱中出現了不同顏色的譜帶或稱色譜圖（Chromatogram）。

當時這種方法并沒引起人們的足夠注意，直到1931年將該方法應用到分離復雜的有機混合物，人們才發現了它的廣泛用途。隨著科學技術的發展以及生產實踐的需要，層析技術也得到了迅速的發展。為此作出重要貢獻的是英國生物學家Martin 和Synge，他們首先提出了色譜塔板理論。這是在色譜柱操作參數基礎上模擬蒸餾理論，以理論塔板來表示分離效率，定量的描述、評價層析分離過程。其次，他們根據液－液逆流萃取的原理，發明了液－液分配色譜。特別是他們提出了遠見卓識的預言：一、流動相可用氣體代替液體，與液體相比，物質間的作用力減小了，這對分離更有好處；二、使用非常細的顆粒填料并在柱兩端施加較大的壓差，應能得到最小的理論塔板高（即增加了理論塔板數），這將會大大提高分離效率。前者預見了氣相色譜的產生，并在1952年誕生了氣相色譜儀，它給揮發性的化合物的分離測定帶來了劃時代的變革；后者預見了高效液相色譜（HPLC）的產生，在60年代末也為人們所實現，現在HPLC 已成為生物化學與分子生物學、化學等領域不可缺少的分析分離工具之一。

因此，Martin 和Synge 于1952年被授予諾貝爾化學獎。如今的色層分析法經常用于分離無色的物質，已沒有顏色這個特殊的含義，但色譜法或色層分析法這個名字仍保留下來沿用。現在我們簡稱為層析法或層析技術。層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。而且它既可以用于少量物質的分析鑒定，又可用于大量物質的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用于科學研究與工業生產上。現在，它在石油、化工、醫藥衛生、生物科學、環境科學、農業科學等領域都發揮著十分重要的作用。

層析的基本理論

層析法是一種基于被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數（或稱分配常數）不同，達到彼此分離的目的。

對于一個層析柱來說，可作如下基本假設：

①層析柱的內徑和柱內的填料是均勻的，而且層析柱由若干層組成。每層高度為H，稱為一個理論塔板。塔板一部分為固定相占據，一部分為流動相占據，且各塔板的流動相體積相等，稱為板體積，以Vm 表示。

②每個塔板內溶質分子在固定相與流動相之間瞬間達到平衡，且忽略分子縱向擴散。

③溶質在各塔板上的分配系數是一常數，與溶質在塔板的量無關。

④流動相通過層析柱可以看成是脈沖式的間歇過程（即不連續過程）。從一個塔板到另一個塔板流動相體積為Vm。當流過層析柱的流動相的體積為V 時，則流動相在每個塔板上跳越的次數為n:n1=v:v1。

⑤溶質開始加在層析柱的第零塔板上。根據以上假定，將連續的層析過程分解成了間歇的動作，這與多次萃取過程相似，一個理論塔板相當于一個兩相平衡的小單元。

層析的基本概念

（1）固定相

固定相是層析的一個基質。它可以是固體物質（如吸附劑，凝膠，離子交換劑等），也可以是液體物質（如固定在硅膠或纖維素上的溶液），這些基質能與待分離的化合物進行可逆的吸附，溶解，交換等作用。它對層析的效果起著關鍵的作用。

（2）流動相

在層析過程中，推動固定相上待分離的物質朝著一個方向移動的液體、氣體或超臨界體等，都稱為流動相。柱層析中一般稱為洗脫劑，薄層層析時稱為展層劑。它也是層析分離中的重要影響因素之一。

（3）分配系數及遷移率（或比移值）

分配系數是指在一定的條件下，某種組分在固定相和流動相中含量（濃度）的比值，常用K 來表示。分配系數是層析中分離純化物質的主要依據。

K = Cs / Cm

其中Cs: 固定相中的濃度，Cm: 流動相中的濃度。