島津原子力顯微鏡在細胞及分子生物學的研究進展

原子力顯微鏡作為一種三維形貌觀察工具，不僅具備超高分辨率，而且支持在液體環境下工作，是一種理想的生命科學/醫學觀測設備。除了形貌觀察外，原子力顯微鏡還可以對多種表面屬性進行定量觀測。例如，基于力學測試的表面機械性能測試。這些性能為原子力顯微鏡應用于細胞和生物分子研究提供了技術基礎。

01 iPS干細胞研究

干細胞的研究一直受制于供體細胞很難獲得，而且相關實驗的倫理風險也不容忽視。因此2007年發明的誘導式多能干細胞(iPS)技術成為理想的胚胎干細胞替代技術。iPS細胞在形態、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、類胚體和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都與胚胎干細胞相似。但是iPS轉化過程中，會有一定的幾率發展為癌細胞。不同體細胞來源的iPS細胞成瘤性有差異。因此，如何篩選安全型iPS細胞是該技術能夠進入臨床實驗的關鍵。

可以使用原子力顯微鏡對未分化的iPS細胞和HeLa細胞進行觀察比較。HeLa細胞是一種被廣泛使用的癌變細胞，因此可以和iPS細胞進行對比觀察。

上圖顯示了SPM形狀圖像(a)HeLa細胞和(b)iPS細胞。用光學顯微鏡觀察到的相應相位差圖像分別顯示在(c)和(d)中。圖中箭頭所示位置處的截面形狀輪廓如(e)和(f)所示。

從細胞形態上來看，HeLa細胞呈圓頂形，表面隆起比較高，約7um；而iPS細胞呈扁平狀且細胞間粘附呈網狀結構，細胞高約1.7um。仔細觀察細胞之間的邊界，可以看出HeLa細胞之間的邊界呈凹陷狀，而iPS細胞之間的邊界是凸起的，而且呈網絡狀。據此可分析得知這兩種細胞各自的細胞間粘附具有差異，且HeLa細胞之間的粘附較弱，而iPS細胞之間的粘附較強。

除了形貌觀察外，原子力顯微鏡還可以通過力學測量獲得細胞表面的機械性能。如下圖所示，用探針針尖壓觸細胞表面，通過對探針獲得的力反饋分析樣品各類機械性能。

使用彈簧常數為0.15N/m的OMCL-TR800PSA探針，在培養液環境中對活細胞進行測試。對細胞的最終壓力(排斥力)為2.5nN。通過比較從探針與樣品接觸的位置到達到2.5nN的力的變化，確定樣品的硬度。

(a)和(b)顯示了SPM觀察到的HeLa和iPS細胞的細胞形狀圖像，(c)和(d)顯示了相應的ZX斷面圖像，是從樣品豎截面方向看時在(a)和(b)中箭頭所示的X線位置處施加到探針的力的圖像。圖中上方為測量起點，下方白色虛線為壓觸終點，顯示了樣品截面形狀輪廓。

在ZX圖像中，探針與樣品接觸后檢測到力的位置以黃色到紅色的顏色顯示。這表明探針對細胞的變形，所以可以理解為較大量的細胞變形顯示出細胞的較軟部分。可以從細胞變形量了解硬度。(c)中的HeLa細胞顯示出均勻的變形，但相比之下，在(d)中的iPS細胞中，細胞體較軟，細胞間粘附區較硬。

分析結果表明，HeLa細胞表面硬度比較均勻，軟硬部分差別不大，而iPS細胞主體較軟，細胞間粘附區較硬。

02 DNA雙螺旋的高分辨觀察

DNA是經常會被觀測的一種樣品，使用基于調幅的輕敲/動態模式，一般只能看清鏈狀結構。

液體環境下輕敲模式掃描DNA鏈

提高液體環境中的分辨率的辦法就是使用調頻模式替代調幅模式（輕敲/動態模式），完美應對了生物樣品的測試需求。

傳統的調幅模式檢測在自由振動和受迫振動下同一頻率處的振幅變化。這種模式受懸臂梁振動質量因子（Q值）的影響非常大，在液體環境中，因為液體對懸臂梁的粘滯阻力，導致Q值急劇降低，從而使分辨率變差。而調頻模式是檢測在自由振動和受迫振動下維持振幅不變時頻率的偏移，在此模式下，分辨率受Q值的影響較小，因此在液體中依然可以保持原子/分子級別的高分辨率。而使用調頻模式，可以對緩沖溶液或者培養液環境下的生物大分子進行超高分辨的觀測，獲得接觸模式或者輕敲模式無法達到的超高分辨率。

同樣是觀察DNA雙螺旋鏈，使用調頻模式，可以清晰地分辨雙螺旋結構，雙螺旋結構形成的大溝小溝結構也非常明顯。

更細致地觀察一個螺距，還可以分辨表面的堿基數目。

對相鄰兩個螺旋的剖面圖進行分析，觀察到的堿基數量與理論值完全符合。這說明調頻模式在液體環境中，對柔軟的生物樣品觀察，依然可以達到基團級別的分辨率。

03 外泌體觀察

外泌體和微泡是醫學和免疫學的前沿研究熱點。然而，對于它們的三維形態和膜的物理性質還有許多方面的認識尚不清楚。外泌體因為其單層膜的性質，所以非常軟，對使用原子力顯微鏡測試提出了極高的要求。

我們用原子力顯微鏡觀察了鹽溶液中的兩類外泌體并對其膜進行了表征。

以上兩幅圖就是不同尺寸的外泌體，其外徑從20nm到140nm不等，表面極其柔軟，楊氏模量一般只有幾千Pa。

原子力顯微鏡作為一種傳統意義上的材料學表面分析工具，隨著其技術的不斷迭代發展，已經深入地滲透到了生命科學/醫學的研究與實驗中。尤其是如生物醫學工程、仿生學等一些交叉學科，新材料新方法的引入已經極大促進了這些領域從理論到實際應用的延伸。

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