差減cDNA文庫的建立實驗

［＋］ 和 ［-］cDNA 文庫（ATCC 或 Stratagene）

TE 緩沖液 EcoRI EDTA 蔗糖溶液 瓊脂糖凝膠 TBE 緩沖液 乙醇 S1 核酸酶 S1 核酸酶緩沖液 苯酚 氯仿 異丙醇 乙酸鈉 AluI RsaI 去離子甲醜胺 SDS 酵母 tRNA 氯仿 異丙醇 磷酸化的 λgt10 連接臂 T4 DNA 連接酶 E.coli C600flA λ 噬菌體包裝抽提物 懸浮介質

離心管

實驗所需「材料」、「試劑」、「耗材」具體見「其他」

1. 從［+］ 和 ［-］ 的細胞或組織獲得 cDNA 文庫。

本方案假設［＋］ 和 ［-］ 文庫是 λ 噬菌體文庫。如果這兩種文庫的載體都是質粒的話，那么它們都只需要 100 ug。插入片段需瓊脂糖凝膠電泳純化，而不僅僅是蔗糖梯度離心純化。

2. 使用大規模的 DNA 純化柱從［＋］和 ［-］ 文庫中各純化＞1 mg 的 DNA。以 1 mg/ml 的濃度重懸于 TE 緩沖液中。

3. 在 1.5 ml 的微量離心管中分別消化兩個文庫的 DNA 各 1 mg，反應如下（終體積 1.167 ml）：

1 ml 文庫 DNA （1 mg）

0.117 ml 10×EcoRI 緩沖液

0.05 ml EcoRI （1000 U）

混勻，37℃ 溫育 5 h。加入 40 ul 0.5 mol/L，pH 8.0 的 EDTA，65℃溫育 10 min 以停止反應。進行消化的時間里，在 38 ml SW-28 管子里準備 4 個 10％～40％ 的蔗糖梯度溶液。兩個管子標記為 ［＋］，兩個管子標記為 ［-］。

插入 cDNA 片段中內在的 EcoRI 位點也會被切開。如果存在這種情況的話，通過這一步獲得的部分長度的cDNA克隆可以被用來制作從起始 ［＋］ 文庫中篩選全長克隆的探針。現在有更新的克隆位點含有如 NotI 位點的載體（如 λZAP），這類載體的出現幾乎可以完全克服上述困難。

4. 每個消化產物中加入等體積的 10％ 蔗糖溶液混勻。將 ［＋］ 文庫的混勻的消化產物分成兩等份，小心地加到兩管標有 ［＋］ 的 10％～40％ 蔗糖梯度溶液上。同樣，將［-］ 文庫的DNA 消化物也加到標有 ［-］的蔗糖梯度溶液上。蔗糖梯度在 20℃ 下，122 000 g （26 000 r/min， SW-28 轉子）離心過夜（18～24 h）。

5. 用吸頭小心移除管底的 0.2 ml 組分，其余每個組分分別放入標記好的微量離心管中，保存于 4℃。

6. 每隔一個組分取 20 ul， 在用 TBE 緩沖液配制的 1.5％ 的瓊脂糖凝凝膠上分析所含的插入 DNA 片段。

7. 每管中加入 0.3 ml TE 緩沖液和 1 ml 95％ 的乙醇，混勻，置于 -20℃ 2 h 或置于干冰上 15 min， 沉淀插入的 DNA 片段。 組分中已含有沉淀 DNA 所需的足夠的 NaCl。為了能夠沉淀出 DNA，蔗糖梯度組分中的蔗糖必須要稀釋。對于低密度組分，常常需要 1～3 倍的稀釋。在高密度的組分中要高效回收 DNA ， 需要更高比例的稀釋。

8. 將沉淀溶液解凍后，用微量離心管高速離心 15 min 收集 DNA。吸出并保存上清， 一直保留到回收 DNA 被檢查確認后方可丟棄。每管加入 0.5 ml 70％ 的乙醇，再次離心，吸出上清，風干沉淀。

9. 重懸、合并來自 ［＋］ 文庫的插入 DNA 于 TE 緩沖液中，終濃度為 0.2 mg/ml。 -20℃保存。

10. 重懸、合并來自 ［-］文庫來的插入 DNA 于 100 TE 緩沖液中，置于冰上。各單獨保存一小份 400 ng 的 ［＋］和 ［-］cDNA， 用作最終文庫的評估。 從 1 mg 總的文庫 DNA 中，預期可以回收到大于 10～15 的插入 DNA。小份的 ［＋］和 ［-］ DNA 也可以用放射性標記，用作 ［＋］文庫的差異篩選探針。

11. 按如下次序混合反應體系（終體積 112 ul）， 去除 ［-］DNA 的 EcoRI 末端。

100 ul ［-］ 插入 DNA （10～15 ug）

11 ul 10 × S1 核酸酶緩沖液

1 ul 1：500 S1 核酸酶（2 U）

渦旋混勻，離心甩至管底，37℃ 溫育 30 min。

12. 加入下述試劑以終止反應：

5 ul 0.5 mol/L EDTA， pH 8.0

200 ul TE 緩沖液

300 ul 苯酚/氯仿/異丙醇

渦旋混勻，離心 1 min 分相，轉移上層水相到一個新的離心管里。加入 30 ul 3 mol/L， pH 5.2 的乙酸鈉，700 ul 乙醇。冷凍，然后按步驟 7、8 離心收集 DNA。沉淀重懸于 100 ul TE 緩沖液中。

13. 用 AluI 和 RsaI 將 S1 核酸酶處理過的 ［-］ 插入 DNA 消化成小片段。按如下次序混合反應體系（終體積 121 ul）：

100 ul ［-］ 插入 DNA （10～15 ug）

12 ul 10×AluI 緩沖液

5 ul AluI（50 U）

4 ul RsaI （60 U）

渦旋混勻，離心甩至管底，37℃ 溫育 3 h。加入 5 ml 0.5 mol/L， pH 8.0 的 EDTA， 65℃ 溫育 10 min 以停止反應。取出 5 ml 消化產物電泳檢驗。

14. 加入 200 ul TE 緩沖液和 300 ul 苯酚/氯仿/異丙醇；按步驟 12 抽提，乙醇沉淀。以 1 ug/pl 的濃度重懸于 TE 緩沖液中。

15. 用 2％ 的瓊脂糖凝膠（TBE 緩沖液中）電泳檢査 步驟 13 中的 5 ul 消化產物，EB 染色。［-］ DNA 的消化片段應當處于 50～200 bp 之間。

16. 用 ［-］DNA 片段雜交 ［＋］ 插入 DNA。在一個 0.4 ml 的微量離心管中加入如下反應體系（終體積 51 ul）

25 ul 去離子甲酰胺（50％ 的最終體積比）

10 ul［-］ DNA 片段（10 ug）

1 ul ［+］ 插入 DNA （0.2 ，ug）

12.5 ul 20×SSC （終濃度為 5×）

0.05 ul 1 mol/L NaPO₄， pH 7.0 （10 mmol/L 終濃度）

0.5 ul 0.1 mol/L， EDTA， pH 8.0 （1 mmol/L 終濃度）

0.5 ul 10％SDS （0.1％ 終濃度）

1.0 ul 10 mg/ml 酵母 tRNA （0.2 mg/ml 終濃度）

渦旋混勻，離心甩至管底，沸水浴變性 5 min。再次輕甩離心管，37℃ 溫育 18～24 h。

17. 加入 200 ul TE 緩沖液，將混合物轉移到一個 1.5 ml 的微量離心管中。用 250 ul TE緩沖液洗滌雜交管后加入雜交混合物（現在的體積是 500 ul） 加入 500 ul 苯酚/氯仿/異丙醇，渦旋混勻，離心 1 min 分相。

18. 轉移上清水相到一個新的離心管里。按上一步用 500 ul 苯酚/氯仿/異丙醇再抽提一次。加入 50 ul 3 mol/L，pH 5.2 的乙酸鈉，1 ml 乙醇，按步驟 7、8 沉淀。沉淀重懸于 12 ul TE緩沖液。

19. 連接插入 DNA 和 λgt10（不是 λgt11）噬菌體臂。混合如下反應體系 （終體積 25 ul）：

12 ul 插入 DNA

10 ul λgt10 磷酸化的臂 （10 ug）

2.5 ul 10× 連接緩沖液

0.5 ul T4 DNA 連接酶（200 U）

用吸頭上下輕輕吹吸混勻，12～15℃ 溫育過夜。

20. 準備一份新鮮的 E.coli C600hflA 的過夜培養液。第二天上午，按照廠家說明，用 8～10 個商品化的 λ 噬菌體包裝抽提物包裝步驟 19 的連接產物。

這里使用 λgt10 載體是因為當生長在合適的宿主菌中時，它可以對重組子進行選擇。10 ug λ 噬菌體載體在摩爾數上大約相當于所加入的 ［＋］ DNA的 EcoRI 末端的摩爾數。必須考慮 ［＋］ DNA 的 EcoRI 末端，即使在變性雜交后只有少部分 ［＋］ 插入 DNA 片段能被克隆。推薦的 10 ug 載體和不少于 8～10 個包裝抽提物能確保很好的文庫多樣性。

21. 包裝混合物中加入懸浮介質，一起倒入一個 5 ml 的聚丙烯管里，調整終體積到 2 ml。加入 2 滴氯仿，用手搖晃 3 s，使氯仿沉淀。

22. 按照文庫的擴增方案，取 0.2 ml 和 3 ml 新鮮的 C600hfA 菌液混合， 接種于 150 mm 的平板上，總共 10 塊。放置于 37℃ 培養過夜。

23. 第二天上午，取一塊平板計數噬斑，所得個數乘以 10 得到文庫中總得重組子。

24. 用懸浮介質洗脫板上的噬菌體或直接跳出單個噬斑篩選。

25. 評估新建的差減文庫。

最好的辦法是擴增文庫，差異篩選兩塊從單個長有 20 000～40 000 個重組子的 150 mm 平板上來的尼龍膜。一塊和總的 ［＋］cDNA 探針雜交，另一塊和總的 ［-］cDNA 探針雜交。總的［＋］ 和［-］cDNA 探針是放射性標記的第 10 步中保存的 ［＋］和［-］cDNA。大多數克隆應當能 和［＋］ 探針雜交，而幾乎沒有能和［-］探針雜交。用一種蛋白探針如 actin 或 tubulin 進行雜交是不合適的，根據多種因素推測，結果是沒有雜交發生（或只有很少）。

1. 材料

［＋］ 和 ［-］cDNA 文庫（ATCC 或 Stratagene）

2. 試劑

TE 緩沖液

EcoRI 和 10×Ec0RI 緩沖液

0.5 mol/L EDTA， pH 8.0

10%（m/V）蔗糖溶液

1.5％ 和 2％ 瓊脂糖凝膠

TBE 緩沖液

95％ 和70％ 乙醇

S1 核酸酶（Sigma）

10×S1 核酸酶緩沖液

25 ：24： 1（V/V/V）苯酚/氯仿/異丙醇 3 mol/L 乙酸鈉，pH 5.2

AluI 和 10×AluI 緩沖液

RsaI

去離子甲醜胺（Fluka，IBI 或 American Bioanalytical）

20×SSC

1 mol/L NaPO₄，pH 7.0

10％ （m/V） SDS

10 mg/ml 酵母 tRNA

24 ： 1 （V/V）氯仿/異丙醇

磷酸化的 λgt10 連接臂（Stratagene）

10×T4 DNA 連接酶緩沖液

T4 DNA 連接酶（以黏性末端單位計；New England Biolabs）

E.coli C600flA

λ 噬菌體包裝抽提物（Stratagene）

懸浮介質（SM）

3. 耗材

SW-28 轉子和 38 ml 離心管（Beckman）或其他類似的管子

0.4 ml 微量離心管