常用的層析分析方法

在分離分析特別是蛋白質分離分析中，層析是相當重要、且相當常見的一種技術，其原理較為復雜，對人員的要求相對較高，這里只能做一個相對簡單的介紹。

一、吸附層析

1、吸附柱層析

吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。

2、薄層層析

薄層層析是以涂布于玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質涂布于載體上形成薄層，然后按紙層析操作進行展層。

3、聚酰胺薄膜層析

聚酰胺對極性物質的吸附作用是由于它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚酰胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚酰胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚酰胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

二、離子交換層析

離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或借助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。

三、凝膠過濾

凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

四、親和層析

親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物(S')才能和一定的酶(E)結合，產生復合物(E-S')一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，并產生復合物。而親和層析與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體(類似底物)是固相存在;后者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體 L(對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M(如活化瓊脂糖等)上，制成親和吸附劑M-L，或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體裝人小層析柱(幾毫升到幾十毫升床體積)后，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，并形成了第一個層析峰。然后，恰當地改變起始緩沖液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，并形成了第M個層析峰 (見圖6-2)。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力(其大小有差異)時，采用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理后，可以重復使用。

上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而后者的配體則一般為簡單的小分子物質(如金屬、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率。

五、聚焦層析

聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為 多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。

聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。

1、PH梯度溶液的形成

在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室(這層析柱者)中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然后打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的 PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由于交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時，先用起始緩沖液(配方見表了一2)平衡到PHg，再用含pH6的多緩沖劑物質(作流動相)的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與堿性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了pH6~9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，并最后恒定于此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。

2.蛋白質的行為

蛋白質所帶電荷取決于它的等電點(PI)和層析柱中的PH值。當柱中的PH低于蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離于交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高于其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，并與陰離子交換劑結合。由于洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低于PI時，它又帶正電荷，并從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，于是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。

不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先后次序是按等電點排列的。