常用緩沖液配制

實驗概要

常用緩沖液配制

實驗步驟

一.電泳緩沖液

　     A: 測序凝膠加樣緩沖液:

　　    98%去離子甲酰

　　    10mol/L EDTA(pH8.0)

　　    0.025%二甲苯青FF

　　    0.025%溴酚藍

        B: 甲酰胺：許多批號的試劑級甲酰胺，其純度符合使用要求，無須再進行處理。不過，一旦略呈黃色，則應用在磁力攪拌器上將甲酰胺與Dowex XG₈混合床樹脂共同攪拌1小時進行去離子處理，并用Whatman 1號濾紙過濾2次，去離子甲酰胺分裝成小份，充氮存于-70℃。
                                                                    常用的電泳緩沖液

　　 說明：
          （1）TBE溶液長時間存放后會形成沉淀物，為避免這一問題，可在室溫下用玻璃瓶保存5×溶液，出現沉淀后則予以廢棄。以上都以1×TBE作為使用液（即1：5稀釋濃貯液）進行瓊脂糖凝膠電泳。但0.5×的使用液已具備足夠的緩沖容量。目前幾乎所有的瓊脂糖膠電泳都以1：10稀釋的貯存液作為使用液。行聚丙烯酰胺凝膠垂直槽的緩沖液槽較小，  故通過緩沖液的電流量通常較大，需要使用1×TBE以提供足夠的緩沖容量。

　　（2）堿性電泳緩沖液應現用現配。

　　（3）Tris-甘氨酸緩沖液用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。

　　C: 2×SDS凝膠加樣緩沖液：

　　  100mmol/L Tris·HCl(6.8)

　　  200mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）

　　  4%SDS（電泳級）

　　  0.2%溴酚藍

　　  20%甘油

　　不含DTT的2×SDS凝膠加樣緩沖液可保存于室溫，應在臨用前取1mol/L貯存液現加于上述緩沖液中。

　　D: 凝膠加樣緩沖液

　　   使用以上凝膠加樣緩沖液的目的有三：增大樣品密度；以確保DNA均勻進入樣品孔內；使樣品呈現顏色，從而使加樣操作更為便利，含有在電塊中能以可預知速率向陽極泳動的染料。溴酚藍在瓊脂糖中移動的速率約為二甲苯青FF的2.2倍，而與瓊脂糖濃度無關。以0.5×TBF作電泳液時，溴酚藍在瓊脂糖中的泳動速率約與長300bp的雙鏈線狀DNA相同，而二甲苯青FF的泳動則與長4kb的雙鏈線狀DNA相同。在瓊脂糖濃度為0.5%～1.4%的范圍內，這些對應關系受凝膠濃度變化的影響并不顯著。
        選用哪一種加樣染料純屬個人喜惡。但是，對于堿性凝膠應當使用溴甲酚綠作為示蹤染料，因為在堿性pH條件下其顯色較溴酚更藍為鮮明。

二．各種pH值的Tris緩沖液的配制

某一特定pH值的0.05mol/L Tris緩沖液的配制：將50ml 0.1mol/L Tris堿溶液與上表所示相應體積（單位：ml）的0.1ml/L HCl混合，加水將體積調至100ml