干貨|細胞治療與基因治療載體純化

　　細胞治療是將細胞轉移到一個病人身上，其目的是改善或治療疾病。細胞治療策略包括分離和轉移特定的干細胞群，執行效應細胞，誘導成熟細胞成為多能性細胞，以及成熟細胞的重新編程。

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　　基因治療是一種新的治療手段，是指將外源正常基因導入靶細胞，以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達到治療目的。即將外源基因通過基因轉移技術將其插入病人的適當的受體細胞中，使用外源基因制造的產物來治療疾病。從廣義說，基因治療還可包括從DNA水平采取的治療某些疾病的措施和新技術。

　　第一個基因療法獲準正式上市。這種CAR-T細胞療法被批準授予諾華制藥以商品名Kymiah用于臨床，治療25歲以下青少年兒童復發性或難治性B細胞急性淋巴細胞白血病(ALL)。FDA在官網稱，這次批準是一次歷史性行動，將為癌癥和其他致命性嚴重疾病開創全新療法。

　　2013年歐洲Glybera是用于治療脂蛋白脂酶缺乏遺傳病（LPLD）的基因藥物。

　　通過一種腺相關病毒（AAV），將產生功能性脂蛋白脂肪酶的基因遞送到患者骨骼肌，患者接受治療后胰腺炎發病率大大降低，并可以放松飲食限制，提高生活質量。2003年，中國賽百諾公司生產的重組腺病毒P-53 (Gendicine) 成功獲得了國家食品藥品監督管理局SFDA 的生產批文，用于治療頭頸部腫瘤的基因療法藥物。

　　細胞及基因治療用基因載體的分離純化策略：

　　1.細胞及基因治療的載體，一般使用病毒或者超螺旋質粒為載體。載體顆較大，幾十至上百納米。在細胞和基因治療中使用的較多的載體有：腺病毒（AdV），逆轉錄病毒（Rv），腺相關病毒（AAV），質粒，慢病毒（LV）等。

　　2.基因載體顆粒一般加大，所以純化時載量偏低

　　3.一般基因載體顆粒帶有負電荷。

　　4.病毒顆粒一般為蛋白衣殼和核酸組成，所以對于剪切力比價敏感。

　　細胞治療與基因治療常用載體特性

　　基因載體分離純化工藝：

　　病毒類載體具有類似的結構表達和擴增系統所以病毒類載體可以使用通用的平臺工藝：

　　腺病毒載體：

　　腺病毒(adenovirus)是一種沒有包膜的直徑為70～90 nm的顆粒，由252個殼粒呈廿面體排列構成。

　　用于治療的腺病毒在純度、活性以及病毒制品中熱源、支原體、雜蛋白、牛血清、Benzonase 的殘留都有嚴格的指標。這就要求在設計生產工藝時，需要選用特異性好，高效的方法分離純化腺病毒載體。層析方法純化腺病毒已成為規模生產的首選方法。以往層析純化腺病毒的方法有很多，如：利用金屬螯和(IMAC Bestarose FF )＋凝膠過濾(S-500 HR、 4FF)、離子交換層析(Q Bestarose XL ) 以及反相層析的方法 等純化方法。 中試或生產規模的腺病毒純化使用QXL陰離子交換，和Bestarose 4 FF分子篩組份分離。

　　病毒類載體的通用平臺工藝

　　病毒類載體的通用平臺工藝：

　　腺病毒純化工藝：

　　第一步：細胞分離：腺病毒培養過程中部分腺病毒分泌到培養基中，部分在細胞中。使用離心或中空纖維將培養基上清和細胞分離，細胞采用凍融的方法裂解或去污劑Triton X-100（濃度通常1%）。加入Benzonase 酶切斷染色體DNA，降低樣品粘度。

　　第二步：澄清，使用中空纖維或離心去除細胞碎片。

　　第三步：濃縮更換緩沖液，將培養上清（如果上清中的病毒顆粒較多，舍棄影響收率）與澄清后的樣品混合，使用中空纖維濃縮，更換為離子交換的緩沖液。使用Q Bestarose XL其緩沖液為50mM TrisHcl ，5% glycerol ，pH 8.0。

　　第三步：陰離子交換純化， 使用 Q Bestarose XL ，采用Nacl 洗脫，通常腺病毒在0.4-0.6M Nacl濃度時被洗脫。洗脫后腺病毒在高鹽緩沖液中。

　　第四步：分子篩組份分離， 使用Bestarose 4/6 FF，上樣一般在5-10%，更換緩沖液。

　　腺相關病毒純化：

　　腺相關病毒（adeno-associated virus AAV）是微小病毒科，無包膜的20面體結構的病毒。病毒顆粒20-26nm。目前還沒有發現AAV對人體致病性，重組的AVV去除了96% 的AAV基因組，進一步確保安全性，2012年10月歐洲批準了第一個基因治療藥物Glybera，就是利用重組的AAV藥物。

　　腺相關病毒的純化近年來有許多報道；多是采用傳統的氯化銫密度梯度超速離心的方法，由于AAV耐受氯仿，所以可以使用氯仿抽提的方法純化AAV-2 載體。氯化銫、氯仿為有毒試劑，在制藥生產中使用有潛在的危害；親和層析（AVB sepharose， Heparin等）的方法是可以使用于生產，但其產品中的殘留量必須是痕量的及有經過認證的嚴格檢測，這就增加了質檢的項目和成本，對工藝的穩定性提出了更高的要求。Nicole Brument 等2002 年提出了使用2 步離子交換(SP Sepharose HP； Source15Q) 方法純化 AAV病毒。陰離子交換是一個純化病毒顆粒的最佳的方法，其中Q XL 可以分離AAV在表達過程中的空病毒顆粒。

　　AAV可以按照病毒載體的通用工藝，設計生產工藝：

　　QXL：Q Bestarose XL 捕獲病毒顆粒，同時去除空的病毒顆粒

　　腺相關病毒顆粒較小，使用凝膠過濾層析的介質可以使用Chromdex 200 PG精細純化步驟。

　　慢病毒純化工藝：

　　慢病毒包括靈長類慢病毒，如人 類免疫缺陷病毒(HIV) 和猴免疫缺陷病毒(SIV) ，以及非靈長類慢病毒如貓免疫缺陷病毒( FIV) 、馬傳染性貧血病毒(EIAV) 、牛免疫缺陷病毒(BIV) 和維斯納-梅迪病毒(VMV)等。目前，HIV-1、HIV-2、SIV、FIV 及EIAV被廣泛研究用作基因治療的載體，而其中又以HIV-1最為熱門。成熟的HIV-1 病毒直徑100～120nm、呈20 面體對稱結構、球形，電鏡下可見一致密圓錐狀核心，內有病毒RNA 分子和酶，后者包括逆轉錄酶、整合酶(integrase) 和蛋白酶(protease)。

　　不同層析介質分離慢病毒載體

　　質粒純化工藝：

　　質粒DNA (pDNA) 又稱基因疫苗。是結構簡單的非病毒載體， 基因疫苗又稱為核酸疫苗(nucleic acid vaccine)，是指將編碼某種抗原的外源基因與質粒載體重組，構建出真核表達載體，通過肌肉注射等途徑直接導入動物細胞后，能利用宿主細胞的蛋白質合成系統合成外源抗原蛋白，并誘導宿主細胞產生對該抗原的體液和細胞免疫應答，以達到預防和治療疾病的目的。由于一般的基因疫苗只含有DNA成份，因此，基因疫苗又常稱為DNA 疫苗(DNA vaccine)。由基因疫苗誘導機體產生的免疫應答，稱為基因免疫(gene immunization) 或核酸免疫( nucleic acid immunization ) 或 DNA 免疫(DNA Immunization)，在質粒DNA 生產過程中需要去除的雜質如表1 所示的大腸桿菌中的主要成分。

　　質粒DNA的純化不同于病毒載體的純化，但是不同的質粒可以使用相同的工藝平臺。

　　質粒純化分為以下步驟：

　　質粒純化工藝路線

　　1.發酵是生產質粒DNA的第一的步驟，也是提高產量的一個較重要的步驟。通過優化宿主細胞、培養條件(如：培養基、溫度、攪拌速度、通氣量、pH等) 可以提高質粒DNA的產量。

　　2.細胞收集可以選用離心、膜過濾的方法。離心是實驗室的常用方法，工業規模一般使用連續流離心機或膜過濾。

　　3.裂解細胞的方法很多，如超聲破碎、高壓勻漿、凍融、酶裂解、堿裂解。質粒DNA 對剪切力和化學試劑比較敏感，如果剪切力過大，質粒DNA 將變性。堿裂解的方法是常用的。NaOH+SDS 可以使得細胞膜溶解，同時促進蛋白質、核酸變性，并保持pDNA的活性。在堿裂解后，加入乙酸鉀，調pH 至5.5。使染色體DNA、蛋白變性沉淀。

　　4.澄清：傳統使用離心機固液分離后超率濃縮。此步驟既可濃縮也可以更換緩沖液。

　　去除RNA，使用凝膠過濾層析的組份分離模式，分離質粒DNA和RNA。

　　5.使用特異分離超螺旋和開環質粒的層析介質捕獲超螺旋質粒。Plasimd Cap Mustang嗜硫親和層析介質特異捕獲超螺旋DNA。

　　6.使用陰離子交換層析介質精純，去除內毒素等雜質。