開年新篇！施一公團隊Science再發剪接體新成果

　　2016年1月8日，清華大學生命學院施一公教授研究組在《科學》（Science）就剪接體的結構與機理研究再發長文（Research Article），題為《U4/U6.U5 三小核核糖核蛋白復合物3.8埃的結構：對剪接體組裝及催化的理解》（The 3.8 A Structure of the U4/U6.U5 tri-snRNP: Insights into Spliceosome Assembly and Catalysis），報道了釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）剪接體組裝過程中的一個關鍵復合物U4/U6.U5 tri-snRNP高達3.8埃分辨率的冷凍電鏡結構，并在此基礎上分析了剪接體的組裝機制，為進一步理解剪接體的激活及前體信使RNA（pre-mRNA）剪接反應的催化機制提供了重要分子基礎。該結構與2015年8月施一公研究組報道的分辨率為3.6埃的裂殖酵母（Schizosaccharomycs pombe）剪接體結構的對比揭示了剪接體在pre-mRNA剪接反應過程中作為核酶（ribozyme）的催化本質，是RNA剪接研究領域的又一重大進展。

　　剪接體作為真核細胞中催化pre-mRNA剪接過程的執行者，是真核生物最基本的分子機器之一，對于正常生命活動具有至關重要的作用。基因的錯誤剪接或剪接體的錯誤調控與許多疾病相關。在剪接反應過程中，組成剪接體的大量蛋白質和核酸分子按照高度精確的順序進行結合和解聚，在此過程中伴隨大規模的結構重組，依次組裝成命名為E、A、B、Bact、B*、C、P、ILS等等的一系列大分子復合物，從而實現對內含子與外顯子交界位點的識別，以及內含子的切除和外顯子的拼接。在近二百種剪接體組分中，U6小核RNA（snRNA）包含對于剪接反應具有直接催化活性的尿嘧啶核糖核苷酸（Uridine）。該核苷酸是如何在起始時被保護從而處于失活構象、又如何在適當時機被釋放激活從而行使催化功能，是揭示剪接體工作機理的核心問題之一。剪接體成分復雜多變、構象高度動態，所以對于剪接體組裝及催化過程中各復合物的結構生物學研究是最基礎也是最富挑戰性的生物學難題之一。

圖1 U4/U6.U5 tri-snRNP電鏡密度及三維結構示意圖。

　　U4/U6.U5 tri-snRNP是剪接體組裝過程中最大也是最保守的預組裝復合物，它由U5小核核糖核蛋白（snRNP），U4、U6 snRNA和其他蛋白因子組成。在該復合物中，U6 snRNA呈現失活構象。U4/U6.U5 tri-snRNP與A復合物結合形成B復合物，再經過一系列成分、構象重組后，U1、U4 snRNP解離，剪接體形成，U6 snRNA從而被激活。所以，tri-snRNP的加入是組裝成具有催化活性的剪接體這個過程中不可或缺的一步，其高分辨率結構的解析對于揭示pre-mRNA剪接反應的分子機理至關重要。早期對于該復合物的結構研究分辨率較低，僅有2納米，除了顯示一個三角形的外觀之外基本不能提供更多信息。2015年6月，英國分子生物學實驗室Nagai研究組利用冷凍電鏡將其分辨率提高至5.9 埃，定位出多個組分，顯示了一些二級結構，但由于分辨率所限，仍不足以搭建原子模型。

　　在施一公研究組最新發表的《科學》論文中，他們探索并優化了蛋白提純方案，獲得了性質良好的釀酒酵母U4/U6.U5 tri-snRNP復合物的蛋白樣品，并利用單顆粒冷凍電鏡技術重構出了總體分辨率為3.8埃的三維結構，核心區域分辨率更是高達3.0-3.5埃，從而首次將該復合物分辨率推進至近原子分辨率，并搭建了該復合物的原子模型（圖1）。該結構清晰顯示由于U6與U4 snRNA的堿基互補配對作用和蛋白因子Prp3的保護作用，U6 snRNA中的催化核苷酸Uridine 80被穩定在失活構象。

圖2 pre-mRNA與tri-snRNP結合。

　　在此高分辨率的結構中，一個出人意料的發現是U4/U6.U5 tri-snRNP復合物中存在著與之結合的pre-mRNA。該pre-mRNA通過與U5 snRNA和U6 snRNA堿基互補配對被識別，其5’剪接位點中高度保守的鳥嘌呤核糖核苷酸（Guanine）被關鍵蛋白Prp8特異性識別。這一發現為剪接體的組裝和剪接反應的催化提供了新的見解（圖2）。

　　醫學院三年級博士生萬蕊雪、清華大學生命學院博士后閆創業為本文共同第一作者；醫學院一年級博士生白蕊和生命學院二年級博士生王琳參與樣品制備和數據收集；施一公教授為通訊作者。中科院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所黃超蘭研究員與黃敏參與樣品質譜鑒定的合作。電鏡數據采集于清華大學冷凍電鏡平臺，計算工作得到清華大學高性能計算平臺、國家蛋白質設施實驗技術中心(北京)以及聯想高性能計算的支持。本工作獲得了北京結構生物學高精尖創新中心及國家自然科學基金委的經費支持。