形形色色的蛋白標簽（二）

　　體內標記

　　對于in vivo標記，人們通常用化學標記的營養物喂養細胞，讓它們摻入新合成的蛋白、核酸或代謝物。之后收獲細胞，分離出這些分子，從整體上查看細胞行為，或利用抗體或其他捕獲試劑來研究某個蛋白。

　　蛋白質組研究人員常用的方法是SILAC，即細胞培養中氨基酸的穩定同位素標記。兩組細胞同時培養，A組是在包含正常氨基酸(light)的培養基中;B組的培養基則含有“重型(heavy)”的氨基酸，即穩定同位素標記的氨基酸。然后將兩組細胞混合，提取出蛋白質組，并交給質譜去測定，從而評估兩種條件下的蛋白豐度差異。生物通之前對此技術有詳細介紹，請看《定量蛋白質組學之SILAC技術》。

　　而非質譜研究人員則使用所謂的生物正交(bioorthogonal)化學反應。在生物正交系統中，人們使用帶有化學基團的分子來喂養細胞，這些化學基團與天然的生物活性基團(如胺基或羧基)不起反應。外源化合物(包含該基團的反應partner)的添加引發化學反應，從而將帶標簽的生物分子與功能基團偶聯。

　　賽默飛世爾提供試劑，讓疊氮化物與膦基團(phosphine group)偶聯。在實驗中，您可以用帶有疊氮化物的分子來喂養細胞，然后，用含有膦基團的試劑處理細胞，它們就會發生反應。這兩種化學基團一般不存在于生物系統中，因此這些分子是惰性的。

　　舉個例子，在培養HK-2細胞時，您可以用N-azidoacetylmannosamine來標記新合成的糖蛋白。之后，用DyLight 650-phosphine處理，觀察這些蛋白。

　　賽默飛世爾目前提供三種不同顏色的膦基團(DyLight 488-Phosphine、DyLight 550-Phosphine和DyLight 650-Phosphine)，以及生物素標記的膦基團，用于蛋白分離。

　　Life Technologies也有類似的點擊化學試劑，名曰Click-iT，相當形象，不過它是基于銅催化的疊氮化物和炔烴之間的共價反應。當然，它也提供不含銅的試劑版本，用于活細胞應用，因為銅對于活細胞是有毒性的。

　　疊氮化物和炔烴都是惰性、穩定的，而且相當小。這些基團可交換，也就是說您可以選擇一個來標記目標分子，而另一個用于隨后的檢測。Click-iT反應可監控新生蛋白的合成或抑制，取代BrdU檢測細胞增殖，鑒定翻譯后修飾(如糖基化和棕櫚酰化)。標記試劑有7種可供選擇，包括6種熒光基團和生物素。

　　這些試劑也可用于脈沖追蹤實驗。首先，用含有疊氮化物的分子和炔烴染料來標記新合成的蛋白，一段時間后，用含有炔烴的分子和不同顏色的疊氮化物染料來喂養細胞，就可以分辨新合成的蛋白與之前的蛋白。

　　體外標記

　　最后一類蛋白標簽是在體外標記蛋白。除了常用的反應性化學試劑(如NHS酯)，一些公司也提供蛋白標記試劑盒，可實現多重質譜分析。這些試劑盒以同量異序標簽(isobaric tag)標記蛋白。這些標簽有著相同的分子量，因此在質譜上表現相同，但它們以不同的方式片段化，可在串聯質譜分析中區分開來。

　　Life Technologies的iTRAQ試劑盒包括8種同量的胺活性試劑，能夠對蛋白質水解的肽段進行標記，結合串聯質譜的方法，可對肽段進行精確的鑒別和定量。這種技術通量高，一次可實現多達8個樣品的蛋白質鑒定。它也能用于多個時間點蛋白質組動態變化的監測。

　　iTRAQ 技術的大體流程如下：樣品一般先經胰蛋白酶裂解、烷基化、酶解為肽段，利用iTRAQ試劑多重標簽對所產生的肽段進行差異標記，再將標記樣本混合，最后用 LC-MS /MS進行分析。iTRAQ試劑包含8種不同的胺活性試劑。每種胺活性試劑與水解后肽段集合。胺活性試劑包含報告基團和平衡基團。

　　iTRAQ 技術可對復雜樣本、細胞器、細胞裂解液等樣本進行相對和絕對定量研究，具有較好的定量效果、較高的重復性，因此近年來應用較廣。它適合所有類型的蛋白樣品，而不像SILAC，不能對組織來源的蛋白進行分析。也正因為如此，它容易受樣本中的雜質蛋白及樣本處理過程中緩沖液的污染，需要對樣本進行預處理并盡量減少操作過程中的污染。

　　賽默飛世爾也推出了串聯質譜標簽(tandem mass tag)試劑盒，被稱為TMT，用于標記實驗。TMT包含帶有氨基活性基團的等量的串聯質譜標簽，一個質量歸一化的連接子，一個可斷裂的化學鍵，和報告離子 (reporter ion)系列。使用這些試劑，研究人員能在一個樣本中專門標記肽和蛋白，然后進行相對或絕對的定量。該方法能夠分析一個樣品中每一個單獨的蛋白，最多可同時分析6個樣品。

　　不過，賽默飛世爾很快將會把TMT產品線升級為新的iodoTMT產品。據介紹，iodoTMT試劑只標記含有半胱氨酸的肽段，而傳統的TMT試劑標記所有肽段。因此，研究人員可使用iodoTMT來研究不同條件下半胱氨酸特異的修飾，比如S-亞硝基化(S- nitrosylation)、氧化和二硫鍵。賽默飛世爾也提供固定化的anti-TMT樹脂，可富集那些包含半胱氨酸的低豐度肽段，否則它們可能無法檢測。

　　蛋白標簽的選擇真的很多，具體選擇哪一個，這取決于您的應用。每個系統都不是完美的，都有優點和缺點。在選擇之前您需要考慮：標簽有多大?它是否會干擾相互作用?這個標簽系統有多少種顏色可選?是否與您的應用兼容?當然，多看文獻肯定沒錯。