徠卡冰凍切片機復型膜的分離與撈取

徠卡冷凍超薄切片是把預先冷凍的樣品在冷凍條件下制備超薄切片的方法。冷凍超薄切片的目的是為了避免常規樣品制備過程個脫水、包埋等步驟，因為這些步驟中的化學和物理因素常常導致細胞的變化，如大分子的變性，抗原或酶活性的喪失，可溶性成份的移位乃至流失。

下面是徠卡冷凍超薄切片法的主要步驟。

一、包裹

1、在一聚乙烯塑料管中加入牛血清白蛋白，貼A溶于0.1ml的磷酸緩沖液中，pH7．2，濃度為10％一20％；

2、符經固定的組織塊表面的殘余液體月濾紙吸干，L一面振動塑料管，一面向其中逐滴加入25％的戊二醛，使管中戊二醛的zui終濃度為2．5％；

L在上述條件下，徽約在半分鐘左右即可被戊二醛交連（聚合），用保險刀片將塑料管壁切除。把聚合的脅切成小方塊，使其大小賂大于包埋于其中的組織塊。如果樣品是游離細胞，可按下進步驟包裹：

1、將帕A加入一離心管內，濃度與上同；

2、把經過固定的細胞轉入離心管；

3、在冷凍離心機上離心10分鐘，800B，40C；

4、去掉上清，在管底沉淀上加一滴用0．1m01／L磷酸緩沖液配制的10％的戊二醛。

5、用針把聚合后的團塊撥起，切成小塊。

為防止冷凍時生成大的冰晶而使結構破壞，組織需經冷凍保護劑處理，常用的冷凍保護劑有甘油和蔗糖，均用緩沖液配制，組織在冷凍保護劑中浸泡的時間為0.5—1J。

為防止大的冰品產生，徠卡冰凍切片機除使用冷凍保護劑外，應采取速凍的辦法，其基本要求與具體作法和冷凍斷裂與蝕刻時相同，即將經冷凍保護的組織塊投入用液氮冷卻的氟里員12內。

二、染色

經過固定和甘油或DM肋保護的組織，其冷凍超薄切片可以使用酷酸鈾和檸檬酸鉛染色。如果冷凍保護劑使用的是蔗糖，上述染色將會使結構嚴重破壞。

對于徠卡冰凍切片機冷凍超薄切片，zui常使用的染色方法是負染。這時，可較正染法看到更多的結構細節。負染的染液有鈞酸銨（2％，PH7．3），醋酸鈾（0.5％，pH4．6）或酸性磷鎢酸（1％，pH6.7）染色時間為15—30秒，室溫。染后，用一濕的濾紙將多余染液吸

以上所述的徠卡冷凍超薄切片制備法適用于形態，細胞化學或免疫標記研究。制備過程中樣品要通過一系列的水溶性介質，可稱為濕法。濕法會使樣品中的可溶性成份流失，因此不能用于這些成份的研究。為研究紹胞中的可擴散的，水溶性成份，應當使用于法制備超薄切片。下面是這一方法的要點。

1、冷凍

將新鮮的未經固定的樣品投入氮糊中。氯糊的溫度為一2900c，可使液氯減壓蒸發而獲得。也可將樣品壓到一個預冷到液氮溫度（-1960c）約銅塊上，再和銅塊一起投入液氮中。

2、切片

LJ片時，樣品溫度為一1400C，刀的溫度為-100-C-1200c，不用槽液。切出的切片有干涉色。用睫毛筆將切片收集到載網上。

3、展平

用一個預冷到液氮溫度的壓模將切片展平

4、干燥

冷凍干燥

5、保存

徠卡冰凍切片機冷凍干燥后的帶有切片的載網的氮氣，并用棉花塞蓋緊。干切法得到的切片不能染色。常規電鏡樣品制備過程中，為保存細胞結構，樣品首先需要用化學固定劑固定。即使在冷凍超薄切片法中，為穩定切片，樣品也需經過固定。而任何化學固定劑都可能使生物大分子變性，從而存在著破壞細胞細微結構的潛在危險。為避免這種可能，是完全不用化學方法而改用物理方法固定組織。冷凍置換就是這樣一種方法。冷凍置換是將新鮮樣品冷凍固定后，在低溫下用某種成份將樣品中的冰置換出來，再行包埋和切片的方法。如呆說冷凍超薄切片法主要是避免了常規電鏡樣品制備中脫水和包埋這些步驟可能造成的人工假象，徠卡冰凍切片機的冷凍置換技術則是避免了化學固定的影響。