徠卡冰凍超薄切片技術

 徠卡冰凍超薄切片技術是使樣品迅速冷凍，然后用冷凍切片機進行徠卡冷凍超薄切片。它省去了普通超簿切片法中繁雜的化學固定與包埋操作，在細胞化學研究中有著特殊的用途。為了很好保存形態結構，必須使游離水形成玻璃態的冰，防止產生冰晶。這就要求很高的冰凍速率（~度/秒），這對于傳熱性能差的生物材料來說是困難的。一般除了盡可能地提高冷凍速率外，還可考慮采用盡可能小的樣品尺寸（小于1立方毫米），對樣品進行冷凍保護處理等，但通常也只能在樣品表面幾微米到幾十微米范圍內能達到玻璃態。更深層將會因冷凍速率低而產生冰晶損傷。

1、儀器準備

進行冷凍超薄切片必須使用專門的徠卡冷凍超薄切片機或配有徠卡冷凍超薄切片附件的普通超曲切片機。德國生產的LeciaCM3050S型和LeciaCM1950凍切片機，可用于冷凍超薄切片。

2、醛類固定

戊二醛固定可良好保存結構和生物大分子的活性，而且結合冷凍保護劑能有效防止冰品的產生。典型的固定液是：0.1M二甲胂酸鈉緩沖液（pH7．2）的2.5％戊二醛溶液，固定時間約1小時，固定溫度37℃。

3、包封

即用某些分子量較大的物質將組織包埋起來，以便切出大面積平整的切片。這些物質不滲入細胞內部，只滲入細胞間隙，起臨時成形和支持作用。具體方法：將組織放在事先溶解好的20％的明膠溶液中保溫15—30分鐘，然后在冰箱中凝固，使樣品包封。也可以用甲基纖維索、牛血清蛋白等代替明膠，不進行包封亦可以獲得較好的切片。

4、徠卡冷凍保護處理

在包封之后，將樣品放在30％~50％甘油中浸泡5~30分鐘，進行冷凍保護處理。甘油效果較好，它不容易污染切片，具有濕潤作用，有利于切片。

5、徠卡快速冷凍

這是獲得高質量冷凍切片的關鍵，常用的方法有三種：

①用液氮直接冷凍在樣品架上滴上一滴緩沖液，放上預處理過的樣品，一起直接放入液氮冷凍。這種方法如上述由于存在汽泡絕熱層，冷凍速率低，效果不佳。

②間接冷凍法采用某些低熔點，高沸點，高熱容量及傳熱好的中間冷媒，如：乙烷、異戊烷、丙烷、氟里昂等。將一金屬容器置于液氮中，再將中間冷媒注入容器中，待中間冷媒冷卻后，然后把樣品投入個間冷媒的容器中冷凍。由于這些冷媒不會沸騰和形成絕熱泡層，因此，冷凍速率高，效果較佳。

③金屑接觸冷凍法將一銅塊至于液氮中，待溫度平衡后，取出銅塊并將樣品與它接觸0.3~0.5秒，使樣品冷凍后，投入液氮中，繼續冷凍。此法出于樣品預先冷凍，樣品放入液統中不會產生絕熱的汽泡層，冷凍效果較好，特別適用于無溶液制備法。

6、切片

要進行徠卡冰凍超薄切片首光必須熟練掌握普通徠卡常規超薄切片技術。在進行切片之前要將樣品塊修整好。方法可用徠卡切片機修塊；也可在液氮中用一長柄刀片修整，但這兩種方法都不易掌握，效果不佳。較合適的方法是：將組織塊在戊二強固定的過程中，用刀片修整成適合于切片的梯形，并仔細放置在樣品架上進行冷凍。