微衛星DNA分子標記及其應用（一）

微衛星（Microsatellite，MS）又稱短串聯重復（Short Tandem Repeats，STR）或簡單序列重復（Simple Sequnce Repeat，SSR），是指基因組中以少數幾個核苷酸（多數為2-4個）為單位多次串聯重復組成的長達幾十個核苷酸的序列。其中最常見的是雙核苷酸重復，如（AC）n、（TG）n等，微衛星DNA廣泛分布在真核生物的基因組中，大約每隔10-550kb就存在一個微衛星。微衛星DNA由于具有特異性的PCR擴增、多態信息容量（PIC）高、引物通用性好、突變率高、共顯性等特點，已經被廣泛應用。

1.微衛星DNA的特點及分類

微衛星DNA具有豐富的多態性，主要表現在核苷酸重復單位數目的多態性和重復序列中核苷酸的替換多態性。一般認為，一個微衛星DNA核心序列重復數目越高，其等位基因數目也就越多，多態性就越豐富。微衛星DNA遵循孟德爾遺傳規律，能夠穩定地從上一代傳給下一代，且等位基因間呈現共顯性遺傳。除此以外，微衛星標記還具有DNA用量少、反應速度快、操作簡易、結果重復性好等特點。

根據重復結構的不同可將微衛星DNA分為3類：完全重復型（perfect），單一序列單元無中斷或無顛倒；不完全重復型（imperfect），單一序列單元有中斷或有顛倒；混合型（compound），多個序列中單位有或無中斷和有或無顛倒的混合。一般說來，微衛星DNA的重復序列兩側都有物種特異性的保守序列，所以，通過設計引物對基因組DNA進行PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳（或聚丙烯酰胺凝膠電泳）和放射自顯影（或銀染），就可以檢測到在簡單重復序列重復單位數不同的DNA區域的多態性，這就是微衛星DNA分子標記。

2.微衛星分子標記方法的優點

微衛星在基因組中是均勻分布的。Winter 等人的研究表明, 除著絲粒及端粒區域外, 染色體的其他區域均廣泛分布有微衛星位點。Litt 和Luty以及Weber 和May各自用熱穩定Tag 酶的PCR 方法證明, 微衛星具有豐富的多態性。用微衛星作為遺傳標記與其他DNA分子標記(包括RFLP、RAPD 和小衛星DNA等) 相比具有以下優點。

2.1 微衛星標記雜合程度高

由于微衛星位點的等位基因數相當多，因而雜合程度高，多態信息含量（PIC）大，在區分親緣關系極近的個體（群體）時的效率比PFLP高。

2.2 微衛星位點可通過PCR擴增

由于小衛星的等位基因一般比較大，在PCR擴增時有一定局限性。而使用微衛星進行PCR擴增，其使用樣品數量少。另外，由于微衛星序列較短，即使降解的DNA也有可能包含足夠用來擴增的微衛星位點，這一特點使那些保存差的樣品也可能成為有價值的研究材料。

2.3 通用性與保守性

微衛星DNA所在區域在生物的基因組中是比較保守的，某一物種的微衛星引物可在相關密切的物種中使用，這使得減少獲取微衛星的工作量和加快比較基因組作圖的工作進度成為可能。

2.4 共顯性遺傳

微衛星DNA呈孟德爾共顯性遺傳模式，可以區別純合顯性個體和雜合顯性個體，這為遺傳研究提供了更多的可供分析的信息。

2.5 微衛星的多態性

多數SSR無功能作用，增加或減少幾個重復序列的頻率高，因而在品種間具有廣泛位點變異，比RFLP及RAPD分子標記更具有多態性。

2.5.1 微衛星突變

微衛星的突變率很高，從而產生了很多等位基因，這就導致了微衛星的高度多態性，一般認為，微衛星豐富的多態性是微衛星不穩定性（microsatellite instability，MI）的表現。微衛星的突變速率在不同物種以及同一物種的不同位點甚至在同一位點的不同等位基因間都存在著很大的差異。在哺乳動物中，大多數的微衛星的突變率估計為每世代10^-6-10^-2人類家系的微衛星平均突變速率為10-⁴；黑腹果蠅受控雌性系中的突變率為每個位點10^-6左右。當微衛星被表達在缺乏有效錯配修復系統的寄主中時，其不穩定性要比正常時高（5-10）×10³左右。

2.5.2 微衛星突變的產生機制

微衛星突變的遺傳學機制現在尚不清楚，目前大多認為微衛星的不穩定性或者與DNA重組過程中的不等交換有關，或者與DNA復制過程中的“滑鏈錯配”有關。

Johnson和Pupko等認為，兩條染色體間的DNA重組過程中發生的不等交換以及基因轉換可能是引起微衛星多態性產生的主要原因。而Levinson等認為在DNA復制合成的過程中，發生了局部解鏈，有微衛星存在的區域新生鏈和模板鏈相對滑動，產生錯配，使得一個或者幾個重復單位形成環狀未能參與配對，從而導致了微衛星多態性的產生。