微生物糖發酵（生化）試驗

實驗概要

本文介紹了單糖發酵試驗、V-P(Voges-Proskauer)試驗、甲基紅試驗、枸櫞酸鹽利用試驗、靛基質（Indol）試驗、硫化氫（H₂S）產生試驗、尿素分解試驗、及氧化酶試驗的原理和基本方法。

實驗原理

1. 單糖發酵是將葡萄糖，乳糖或麥芽糖等分別加入蛋白胨水培養基內，使其最終濃度為0.75~1％。并加入一定量酚紅指示劑及小倒管，制成單糖發酵管，接種細菌經37℃培養18~24小時，若能分解糖產酸則酚紅指示劑由紅變黃，若能分解甲酸有CO₂和H₂等氣體形成，小倒管內則聚集有氣泡；不分解，則指示劑不變色。

2. 有些細菌如產氣桿菌，分解葡萄糖產生丙酮酸，丙酮酸脫羧，生成乙酰甲基甲醇，在堿性環境中被氧化為二乙酰，再與培養基內胍基結合，生成紅色化合物，V—P試驗陽性。

3.  某些細菌如大腸桿菌等分解葡萄糖產生丙酮酸，繼而分解為甲酸、乙酸、乳酸等，使培養基PH值降至4.5以下，加入甲基紅指示劑呈紅色，此為陽性反應；若產酸量少或產生的酸進一步轉化為醇、醛、氣體和水等，則培養基的酸堿度仍在pH  6.2以上，加入甲基紅指示劑呈現黃色，為陰性反應。

4.  枸櫞酸鹽培養基系一綜合性培養基，其中枸櫞酸鈉為唯一碳源，磷酸二氫銨為唯一氮源。一般細菌能利用磷酸二氫銨作為氮源，但不一定能分解枸櫞酸鹽取得碳源。因此，根據可否利用枸櫞酸鹽來鑒別細菌，如產氣桿菌可利用枸櫞鹽作為碳源，細菌生長繁殖，形成菌苔，分解枸櫞酸鹽生成堿性碳酸鹽，使培養基pH上升到7.0以上，由綠色變為深蘭色，為枸櫞酸鹽利用試驗陽性；而大腸桿菌則不能分解枸櫞酸鹽，得不到碳源，不能生長，無菌苔形成，培養基顏色不發生變化，為枸櫞酸鹽利用試驗陰性。

5. 某些細菌如大腸桿菌，變形桿菌等具有色氨酸酶，能分解蛋白胨水培養基中的色氨酸，產生靛基質（無色吲哚），再與歐立希試劑（對二甲基氨基苯甲醛）反應，形成紅色化合物—玫瑰吲哚，即為陽性反應。

6. 某些細菌能分解培養基中的含硫氨基酸（如胱氨酸、半胱氨酸），生成硫化氫。硫化氫遇到培養基中的鉛鹽（醋酸鉛）或鐵鹽（硫酸亞鐵），則形成黑褐色硫化鉛或硫化亞鐵沉淀物。培養基內含有還原劑硫代硫酸鈉，使形成的硫化氫不再氧化。

7. 某些細菌如變形桿菌，具有尿素分解酶，能分解尿素而產生氨，氨溶于水變成氫氧化銨，使培養基變堿而呈紅色即為陽性。

8. 某些細菌如奈瑟菌和綠膿桿菌，具有氧化酶（靛基酚氧化酶），能將氧化酶試劑（鹽酸二甲基對苯二胺或四甲基對苯二胺）氧化成紅色的醌類化合物，即為氧化酶試驗陽性。

主要試劑

1. 單糖發酵試驗培養基：葡萄糖發酵管，乳糖發酵管等。

2. V-P(Voges-Proskauer)試驗培養基：葡萄糖蛋白胨水培養基。試劑：V-P試劑[40％氫氧化鉀水溶液(內含0.3％肌酸)和6%α-奈酚酒精溶液]。

3. 甲基紅試驗培養基：葡萄糖蛋白胨水培養基。試劑：甲基紅試劑。

4. 枸櫞酸鹽利用試驗培養基：枸櫞酸鹽斜面。

5. 靛基質（Indol）試驗培養基：蛋白胨水培養基。試劑，歐立希（Ehrlich）試劑（對二甲基氨基苯甲醛）。

6. 硫化氫（H₂S）產生試驗培養基：醋酸鉛培養基。

7. 尿素分解試驗培養基：尿素培養基。

8. 氧化酶試驗培養基：巧克力平板。試劑：0.5-1%鹽酸對二甲基苯胺（或鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸對氨基二甲苯胺）水溶液。

實驗材料

1. 單糖發酵試驗菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。

2. V-P(Voges-Proskauer)試驗菌種：大腸桿菌，產氣桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。

3. 甲基紅試驗菌種：大腸桿菌，產氣桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。

4. 枸櫞酸鹽利用試驗菌種：大腸桿菌，產氣桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。

5. 靛基質（Indol）試驗菌種：大腸桿菌，傷寒桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。

6. 硫化氫（H₂S）產生試驗菌種：大腸桿菌，傷塞桿菌18~24小時瓊脂斜面培養物。

7. 尿素分解試驗菌種：變形桿菌，傷寒桿菌18-24小時瓊脂斜面培養物。

8. 氧化酶試驗菌種：淋球菌或腦膜炎球菌，白色葡萄球菌18-24小時巧克力斜面培養物。

實驗步驟

1. 單糖發酵試驗

(1). 將傷寒桿菌，大腸桿菌按照液體接種方法分別接種于葡萄糖及乳糖發酵管內。

(2). 置37℃孵箱培養18~24小時。

(3).  觀察結果：由于一些細菌能分解某種糖類產酸，所以培養基中pH下降到7.0以下，在酚紅指示劑的顯示下，培養基顏色由紅變黃。產酸者以“  ”表示，如果同時產生氣體，則培養基中小倒管內有氣泡出現，此乃產酸又產氣，以“⊕”表示，不分解，則指示劑不變色，用“-”表示。

(4). 實驗結果

傷寒桿菌大腸桿菌

葡萄糖   ⊕

乳糖 - ⊕

2. V-P(Voges-Proskauer)試驗

(1). 分別接種大腸桿菌，產氣桿菌于兩支葡萄糖蛋白胨水中。

(2). 置37℃培養48小時后，取出分別加入KOH1ml和α-奈酚溶液1ml ,搖勻，靜置試管架上5~15分鐘。

(3). 實驗結果

培養液變為紅色為陽性，不變色為陰性。

3. 甲基紅試驗

(1). 分別將大腸桿菌，產氣桿菌接種于兩支葡萄糖蛋白胨水培養基中。

(2). 置37℃培養2~3天取出，分別滴加甲基紅試劑2~3滴，混勻，觀察結果。

(3). 實驗結果

大腸桿菌： ，產氣桿菌：-。

4. 枸櫞酸鹽利用試驗

(1). 分別將大腸桿菌，產氣桿菌接種于兩支枸櫞酸鹽斜面培養基。

(2). 置37℃恒溫培養24小時后觀察結果。

(3). 實驗結果

產氣桿菌： （有菌苔生長，培養基變色）

大腸桿菌：-（無菌苔生長，培養基不變色）

5. 靛基質（Indol）試驗

(1). 分別將大腸桿菌，傷寒桿菌接種于兩支蛋白胨水培養基中。

(2). 置37℃培養2~3天后，每管沿管壁各加歐立希試劑0.5~1ml于培養液面上，待1-2分鐘后觀察結果：在交界面出現玫瑰紅色環即為吲哚試驗陽性，無紅色環即為陰性。

(3). 實驗結果

大腸桿菌：  ；傷寒桿菌：- 。

6. 硫化氫（H₂S）產生試驗

(1). 分別以半固體穿刺接種法將大腸桿菌，傷寒桿菌穿刺接種地兩支醋酸鉛培養基內。

(2). 置37℃培養48-72小時（2-3天）。

(3). 觀察結果：取出后對光觀察，若沿穿刺線有黑褐色沉淀物，即表示該菌能產生硫化氫（H2S），否則反之。

(4). 實驗結果

大腸桿菌：-（無黑色沉淀線生成）

傷寒桿菌： （有黑色沉淀線生成）

7. 尿素分解試驗

(1). 分別以斜面接種法將變形桿菌，傷寒桿菌接種于兩支尿素斜面培養基上。

(2). 置37℃培養18-24小時。

(3). 取出觀察結果，培養基變為紅色，即尿素分解試驗陽性，若不變色，即為尿素分解試驗陰性。

(4). 實驗結果

變形桿菌：  ；傷寒桿菌：- 。

8. 氧化酶試驗

(1). 將腦膜炎球菌或淋球菌，白色葡萄球菌分別接種于巧克力平板；

(2). 置37℃培養24小時后取出；

(3). 滴加新鮮配制的0.5-1%鹽酸對二甲基苯胺水溶液于固體培養基上；

(4). 觀察結果：加試劑后，若菌落出現紅色→深紅色→紫黑色變化均為陽性；反之陰性。

(5). 實驗結果

腦膜炎球菌和淋球菌：  ；白色葡萄球菌：- 。

注意事項

1. 氧化酶試驗應避免含鐵物質，因遇鐵會出現假陽性；試劑在空氣中易氧化，故應新鮮配制，冰箱保存使用不超過兩周；若要分離培養腦膜炎球菌，應在菌落變成紫黑色之前立即轉種。否則細菌容易死亡。

2. 《附錄》

(1). V-P試驗劑的配制

甲液：α-萘酚 6g 95%灑精 100ml

乙液：KOH 40g 肌酸0.3g 蒸餾水 100ml

(2). 甲基紅試劑的配制

甲基紅 0.04g 95%酒精 60ml 蒸餾水 40ml

先使甲基紅溶解于酒精中，再加入蒸餾水，混合，搖勻即成。

(3). 歐立希（Ehrlich）試劑的配制

對位二甲基氨基苯甲醛 4g

95%酒精 380ml

濃硫酸或濃鹽酸80ml

三種成分混合即成，瓶口要嚴密，以免揮發。

(4). 蛋白胨水培養基的制備

成分：蛋白胨10g 氯化鈉5g 蒸餾水1000ml

制法：

1). 先用少量蒸餾水將蛋白胨和氯化鈉相混合溶解,再加足蒸餾水量。

2). 調節pH至7.6、用濾紙過濾。

3). 分裝中試管，每管約3-4ml，加塞滅菌后備用。

用途：供吲哚試驗用

(5). 單糖發酵管的制備

成分：蛋白胨水培養基 100ml

0.2%酚紅 1ml

所需糖（葡萄糖或乳糖）0.75-1g

制法：

1). 將上述成分溶化，混勻分裝于內含有倒置小玻璃管的小試管中，每管約2ml，加塞。

2). 小倒管排氣，滅菌（8-10磅，20-30分鐘），貯存備用。

用途：供單糖發酵試驗用。

附注：0.2%酚紅配制法

酚紅（phenol red）0.2g

1/10苛性鈉（NaOH） 8ml

蒸餾水 92ml

將酚紅入研缽徐徐加入苛性鈉研磨，再補足蒸餾水即成。若需長時間保存，可高壓滅菌后貯存備用。

(6). 葡萄糖蛋白胨水培養物

成分：蛋白胨5g 葡萄糖5g

制法：

1). 將上述成分溶解于蒸餾水中。

2). 調節pH至7.6，用濾紙過濾除渣。

3). 分裝中試管，每管約3-4ml，滅菌后備用。

用途：供甲基紅及V-P試驗用。

(7). 枸櫞酸鹽斜面培養基的制備

成分：磷酸二氫銨0.1g 磷酸氫二鉀0.1g

硫酸鎂0.02g 枸櫞酸鈉0.23g

氯化鈉0.5g 瓊脂2g

蒸餾水100ml 0.5%溴麝香草酚藍酒精溶液2ml

制法：

1). 先將上述各種鹽類溶解于蒸餾水中，使其完全溶解。

2). 矯正pH至6.8，然后加入瓊脂和指標劑。

3). 搖勻，脫脂棉過濾，分裝中試管，每管約3-5ml。

4). 滅菌后置成斜面備用（冷后為綠色）

用途：供枸櫞酸鹽利用試驗用。

(8). 醋酸鉛培養基的制備

成分：2%肉湯瓊脂200ml 硫代硫酸鈉0.05g

醋酸鉛10g 蒸餾水100ml

制法：

1). 先將10g醋酸鉛加入100ml蒸餾水中融化，間歇滅菌或低壓菌后備用（10%醋酸鉛溶液）。

2). 加熱溶化2%肉湯瓊脂200ml，加入硫代硫酸鈉0.05g，混合后高壓滅菌。

3). 從高壓滅菌鍋取出，待冷卻至45℃左右時。無菌操作加入無菌的10%醋酸鉛溶液1毫升，搖勻。

4). 分裝小試管，每管約2ml，直立待冷凝后備用。

用途：供硫代氫生成試驗用。

說明：醋酸鉛與硫代硫酸鈉不宜久然。

(9). 尿素培養基的制備

成分：蛋白胨1g 氯化鈉5g

葡萄糖1g 蒸餾水900ml

瓊脂15~20g 0.1%酚紅 12ml

20%尿素水溶液（無菌）100ml

制法：

1). 除尿素、瓊脂和酚紅外，其余成分溶于水中，加熱溶化，矯正pH至6.8~6.9。

2). 加入瓊脂和酚紅，8~10磅10分鐘滅菌。

3). 冷卻至60℃后加入無菌尿素溶液，搖勻。

4). 分裝中試管（無菌），每管3~4ml，置成斜面備用。

用途：供尿素分解試驗用。

說明：

1). 尿素不耐熱，也不能久存，只能用濾器除菌。

2). 無菌尿素溶液制備：稱取尿素20g，混合于100ml蒸餾水中，充分搖勻，用G6濾菌器過濾除菌，以達到無菌的目的。

(10). 巧克力色瓊脂平板的制備

成分：肉湯瓊脂100ml 無菌脫纖維羊或兔血10ml。

制法：

1). 將肉湯瓊脂加熱溶化，趁熱加入脫纖維血，搖勻。

2). 傾注平板，待冷卻成巧克力色，備用。

用途：用于培養腦膜炎雙球菌或淋球菌。

說明：加血一定要趁熱加。