微生物細胞大小測定及顯微鏡直接計數

實驗概要

微生物細胞的大小是微生物重要的形態特征之一，由于菌體微小，只能在顯微鏡下測量。用于測量微生物細胞大小的工具有目鏡測微尺和鏡臺測微尺。

目鏡測微尺（圖示）是一塊圓形玻片，在玻片中央把5mm長度刻成50等分，或把10mm長度刻成100等分。測量時，將其放在接目鏡中的隔板上，此處正好與物鏡放大的中間物像重迭，用于測量經顯微鏡放大后的細胞物象。由于不同目鏡、物鏡組合的放大倍數不相同，目鏡測微尺每格實際表示的長度也不一樣，因此目鏡測微尺測量微生物大小時須先用置于鏡臺上的鏡臺測微尺校正，以求出在一定放大倍數下，目鏡測微尺每小格所代表的相對長度。鏡臺測微尺（圖示）是中央部分刻有精確等分線的專用載玻片，一般將1mm等分為100格，每格長10μm即0.01mm，是專門用來校正目鏡測微尺的。校正時，將鏡臺測微尺放在載物臺上，由于鏡臺測微尺與細胞標本是處于同一位置，都要經過物鏡和目鏡的兩次放大成像進入視野，即鏡臺測微尺隨著顯微鏡總放大倍數的放大而放大，因此從鏡臺測微尺上得到的讀數就是細胞的真實大小，所以用鏡臺測微尺的已知長度在一定放大倍數下校正目鏡測微尺，即可求出目鏡測微尺每格所代表的實際長度，然后移去鏡臺測微尺，換上待測標本片，用校正好的目鏡測微尺在同樣放大倍數下測量微生物細胞大小。

測定微生物細胞數量的方法很多，通常采用的有顯微鏡直接計數法和稀釋平板計數法。

直接計數法適用于各種單細胞菌體的純培養懸浮液，如有雜菌或雜質，則難于直接測定。菌體較大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球計數板，一般細菌則采用彼德羅夫·霍澤（Petrof   Hausser）細菌計數板。兩種計數板的原理和部件相同，只是細菌計數板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數板較厚，不能使用油鏡，計數板下部的細菌難于區分。

血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載坡片上有4條槽所構成的3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個計數區（圖示），計數區的刻度有兩種：一種是計數區分為16個大方格，大方格用三線隔開，而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數區分成25個大方格，大方格之間用雙線分開，而每個大方格又分成16個小方格。但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。

計數區邊長為1mm，則計數區的面積為1mm²，每個小方格的面積為1/400 mm²。蓋上蓋玻片后，        

計數區的高度為0.1mm，所以計數區的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為1/4000 mm³。

使用血球計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算成每mL菌液（或每g樣品）中微生物細胞的數量。

已知：1mL體積＝10 mm×10 mm×10 mm＝1000mm³      

所以：1mL體職應含有小方格數為1000mm³/（1/4000mm³）＝4×106個小方格，即系數K＝4×10⁶。

因此：每mL菌懸液中含有細胞數＝每個小格中細胞平均數（N）×系數（K）×菌液稀釋倍數（d）。

主要設備

顯微鏡、目鏡測微尺、鏡臺測微尺、蓋玻片（22mm×22mm）、載玻片、滴管、雙層瓶、擦鏡紙、血球計數板、吸水紙、計數器。

實驗材料

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）斜面菌種或培養液、枯草桿菌（Bacillus subtilis）染色標本片。

實驗步驟

1. 微生物細胞大小的測定

   1) 目鏡測微尺的校正

把目鏡的上透鏡旋下，將目鏡測微尺的刻度朝下輕輕地裝入目鏡的隔板上，把鏡臺測微尺置于載物臺上，刻度朝上。先用低倍鏡觀察，對準焦距，視野中看清鏡臺測微尺的刻度后，轉動目鏡，使目鏡測微盡與鏡臺測微尺的刻度平行，移動推動器，使兩尺重迭，再使兩尺的“0”刻度完全重合，定位后，仔細尋找兩尺第二個完全重合的刻度（圖示），計數兩重合刻度之間目鏡測微尺的格數和鏡臺測微尺的格數。例如：目鏡測微尺5小格正好與鏡臺測微尺5小格重迭，已知鏡臺測微尺每小格為10μm用同樣方法分別校正在高倍鏡下和油鏡下目鏡測微尺每小格所代表的長度。由于不同顯微鏡及附件的放大倍數不同，因此校正目鏡測微尺必須針對特定的顯微鏡和附件（特定的物鏡、目鏡、鏡筒長度）進行，而且只能在該顯微鏡上重復使用，當更換不同顯微鏡目鏡或物鏡時，必須重新校正目鏡測微尺每一格所代表的長度。刻度重合

   2) 細胞大小的測定

          a. 將酵母菌斜面制成一定濃度的菌懸液（10－2）。

          b. 取一滴酵母菌菌懸液制成水浸片。

            c. 移去鏡臺測微尺，換上酵母菌水浸片，先在低倍鏡下找到目的物，然后在高倍鏡下用目鏡測微尺來測量酵母菌菌體的長，寬各占幾格，不足一格的部分估計到小數點后一位數。測出的格數乘上目鏡測微尺每格的校正值，即等于該菌的長和寬。一般測量菌體的大小要在同一個標本片上測定10～20個菌體，求出平均值，才能代表該菌的大小。待測微生物需用培養至對數生長期的菌體進行測定。

          d. 同樣方法用油鏡測定枯草桿菌染色標本的細胞大小。

2. 微生物細胞的顯微直接計數法

   1) 視待測菌懸液濃度，加無菌水適量稀釋（斜面一般稀釋到10^-2），以每小格的菌數可數為度。

   2) 取潔凈的血球計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。

    3)  將酵母菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣滴入一小滴，不宜過多，讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡產生，并用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上，注意不要使計數區兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區深度的升高。然后加蓋蓋玻片，勿使產生氣泡。

   4) 靜置片刻，將血球計數板置載物臺上夾穩，先在低倍鏡下觀察到計數區后，再轉換高倍鏡觀察并計數。由于活細胞的折光率和水的折光率相近，觀察時應適當關小孔徑光闌并減弱光照的強度。

     5) 計數時若計數區是由16個大方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的4個大方格（即100小格）的菌數。如果是25個大方格組成的計數區，除數上述四個大方格外，還需數中央1個大方格的菌數（即80個小格）。如菌體位于大方格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。

   6) 對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品重復計數2～3次，每次數值不應相差過大，否則應重新操作，求出每一個小格中細胞平均數（N），按公式計算出每mL(g)菌懸液所含酵母菌細胞數量。

   7) 測數完畢，取下蓋玻片，用水將血球計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免損壞網格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，放入盒內保存。