懸浮細胞培養經驗

　　6 細胞培養基的選擇

　　6.1根據細胞特點、蛋白表達及病毒特點和培養方式選擇細胞培養基

　　商售工業用細胞培養基主要是干粉培養基，常用的培養基主要包括199、MEM、RPMI-1640、DMEM、DMEM/F12等系列，根據細胞的特性及工業化的生產需求，開發或生產的同一系列的細胞培養基在成份上也有一定的變化，如MEM細胞培養基有含Earle's平衡鹽的類型，也有含Hanks'平衡鹽的類型；依據除菌方式又可分為高壓滅菌型和過濾除菌型；還有含非必需氨基酸的類型，及是否含有酚紅等；DMEM培養基分為高糖型和低糖型，據此結合實際培養的細胞特點、產品特點及生產工藝等進行選擇和優化，最終選擇的培養基需要達到以下目標：

　　1.提高細胞密度和細胞活力；

　　2.提高單位體積培養液中病毒量或抗體表達量，提高生產效率；

　　3.降低動物來源成份，簡化純化成本，提高生物制品的安全性。

　　不同的細胞株甚至同一細胞株在不同的培養條件下都有著不同的營養需求，細胞作為病毒等繁殖的宿主，為細胞株選用合適的培養基，使細胞保持快速增殖和高活率狀態，才能夠提高生物制品的產率。在選用合適的細胞培養基時可根據以下幾種方法進行：

　　可從細胞系最初建系用培養基，也可從細胞的來源處獲得，細胞庫（如ATCC、ECACC）可以提供常用細胞系所用培養基的信息。但該種細胞培養基通常選擇的是最基礎的培養基。

　　1.還可用多種細胞培養基培養目的細胞，觀察其生長狀態，可用生長曲線、集落形成率等指標判斷，根據試驗結果選擇最佳培養基，這是最客觀的方法，但比較繁鎖。

　　2.也可根據本實驗室慣用的細胞培養基，許多培養基可以適合于多種細胞，通過幾種培養基的選擇測試進行挑選，亦可參考一些經驗（見表6-1），縮小選擇的范圍。

　　3.針對細胞特點及培養工藝需要。

表6-1 傳代細胞系常用的細胞培養基

　　培養細胞的目的是使其表達生產相應的目的物，因此，在滿足細胞生長增殖的基礎上，細胞培養基的開發還應滿足病毒等在細胞中的高表達及性能穩定性。同一株細胞可以作為幾種生物制品的生產平臺（如上表中所列）、同一病毒液可在幾種宿主細胞中表達，因此，選擇最優化的宿主細胞及最高產品表達量是生物制品廠家追求的一個目標，而相應細胞培養基的正確選擇是促使目標實現的一個重要影響因素。LONZA公司2005年【12】研究結果表明，同一細胞株，采用優化后的限定化學成份細胞培養基與傳統的合成細胞培養基相比，蛋白表達量提高了9.6倍，從該結果可以看到細胞培養基的選擇和優化對于提高產物表達量的重要性。

　　生產工藝的革新或改進是提高生產效率、降低生產成本的一個有效途徑，相應細胞培養基的支持顯得較為重要。如由轉瓶培養轉換為生物反應器培養時，傳統的合成細胞培養基較難滿足生物反應器中細胞的高密度生長、抗剪切力、降低表面張力等需要，則需要更換相應的懸浮培養用細胞培養基滿足上述需求。在有血清懸浮培養轉至無血清懸浮培養時，缺少了血清的保護和促增殖作用，相應無血清培養基的支撐顯得更為重要。

　　隨著細胞培養技術及基因工程技術的發展，細胞株的改造和馴化技術提高，高表達細胞株或是懸浮細胞株（貼壁細胞懸浮化培養等）的構建、馴化，如細胞由貼壁培養狀態向懸浮培養狀態轉換時，或是在有血清懸浮培養轉至無血清懸浮培養時，細胞的代謝狀況可能發生改變，傳統用細胞培養基可能不能適應改造后或是馴化后細胞株的生長增殖需求，相應個性化細胞培養基的支撐顯得更為重要。相應個性化細胞培養基的支撐顯得更為重要。這些個性化細胞培養基或是直接來自細胞培養基生產廠家的革新、或是與使用者共同開發定制的專業化細胞培養基。

　　6.2選擇高品質的細胞培養基

　　細胞培養基作為原材料直接影響生物制品的質量。無論是國產細胞培養基還是進口細胞培養基，由于國內目前還無明確的法律法規來規范細胞培養基的產、銷過程，各企業執行各自的生產工藝及產品配方，由于信息的不對稱，細胞培養基生產企業存在的諸多問題，尤其是安全性問題并不能被用戶所了解。生物制品生產企業需篩選真正符合生物制品原材料質量要求的培養基，從源頭上控制好生物制品的安全風險，需建立基本的產品檢驗標準，尤其在沒有統一法規、行規的條件之下，只能通過挑選合格的供應商、自身建立一套質量檢驗體系，對每批產品進行檢驗等確保培養基的質量。

　　6.3從經濟性、安全性角度選擇合適的細胞培養基

　　隨著生物制品安全性要求的提高，細胞培養基作為生物制品的一個重要原材料，直接影響其產品的質量和安全性。當前，基于人、蓄安全性角度考慮，國外許多法規要求采用不含動物組份的細胞培養基，無動物來源成份的無血清細胞培養基將是生物制品企業選擇的趨勢所在。

　　除滿足安全性需求外，選擇細胞培養基時價格也是不得不考慮的一個因素。工業化通常直接購買供應商的干粉細胞培養基，有些培養基可能需要添加谷氨酰胺，大部分基礎合成細胞培養基中需要添加一些血清。隨著對生物制品安全性要求的提高，并滿足生物制品體外生產時需要去除動物蛋白的要求，針對一些連續細胞系，設計了個性化的低血清細胞培養基及無血清細胞培養基，雖然這些培養基的價格較為昂貴，但相比血清給后期純化及產品質量帶來的影響，這些培養基生產的產品質量和安全性明顯較高，相應產品的市場競爭力增強、市場占有率提升，企業的最終的生產效益提高。

　　6.4供應商的選擇

　　選擇細胞培養基的同時也需考核、選擇供應商。

　　目前，國內細胞培養基行業管理存在缺失現象，國內細胞培養基行業沒有統一的生產質量管理規范。生物制品企業除自身建立一套質量檢驗體系外，挑選合格的細胞培養基供應商是進行原材料質量控制的另一種重要的方法。選擇供應商時可通過對比細胞培養基生產企業在硬件和軟件上的情況和差距，對細胞培養基的原材料、生產過程、生產環境、生產用設備、應用性檢測、安全性檢測等方面檢查并評估供應商的生產、質控能力。

　　國產與進口細胞培養基的生產及銷售渠道可能會有一定差別，進口產品供貨周期有一定限制，在國產和進口培養基均能夠滿足生物制品廠家要求的時候，國產細胞培養基相應是較好的選擇，原因主要包括兩個方面，一方面國產細胞培養基在價格上存在優勢，生產同樣的產品，與國內細胞培養基廠家相比，技術水平和可信度較高的國外細胞培養基廠家通常整體規模較大，相應的產品生產及運營費用較高，導致產品價格昂貴；另一方面，細胞培養基使用廠家可直接考核國內供應商，易于使用廠家控制細胞培養基的質量，并更易獲得產品性能相關的技術支持及售后技術服務。