慢病毒制備步驟及注意事項

慢病毒包裝技術專題

現今常用的制備慢病毒載體  的方法為使用3或者4質粒系統轉染293T細胞。此外，也有使用其它幾類慢病毒包裝細胞系制備慢病毒載體。

瞬時轉染制備慢病毒  ：

細胞：慢病毒包裝常用人胚腎細胞(HEK, human embryonic kidney)293  T，其含有SV40病毒的大T抗原蛋白編碼基因，轉染效率極高。但其貼壁性不好，所以需要使用多聚賴氨酸包被的培養皿增加其吸附性。多聚賴氨酸培養皿可購買，也可自行制備。轉染前，細胞密度控制在40-70%比較好。

DNA：每10 cm培養皿約含5x106 293T細胞，需用30-40 ug不含內毒素的質粒進行轉染。質粒的純度對慢病毒載體的包裝效率非常關鍵。不同的包膜蛋白表達載體，其使用量也不同。

轉染：最經濟的轉染方法是磷酸鈣轉染法，雖然其溶液配置影響因素多，不易穩定重復得到最佳的轉染結果。其它方法有脂質體法和PEI法。轉染48-60后可以收集上清，通過低速離心，然后濾膜過濾可以去除上清中的細胞碎片。

如果使用VSV-G包膜蛋白的話，可以通過兩次超速離心進行濃縮，從而最高可以獲得滴度高達1011-1012IU/ml的慢病毒載體。之后可以將病毒載體溶解在PBS， HBSS或者DMEM中，并置于-800C儲存。

儲存溶液添加血清會幫助提高病毒凍融時的存活率，然而有些病毒在侵染細胞時，血清會有干擾，所以需要依據具體病毒種類考慮是否添加血清。

病毒滴度：含VSV-G的慢病毒載體，其滴度在濃縮前一般為107IU/ml，濃縮之后可以達到109-107IU/ml 。

含有熒光標記或者其它報告基因的病毒載體，可以通過梯度稀釋侵染HeLa或者293，NIH3T3細胞來確定其滴度;不含報告基因的可通過測定病毒顆粒中相關病毒蛋白的活性或者含量來確定其滴度，比如使用p24gag的ELISA試劑盒。一般來說，每4-60 x 103個病毒載體含1ng p24gag。

然而這種方法測出來的滴度并不準確，不同的病毒載體類型，不同的儲存方式，都會導致p24gag和病毒載體顆粒的比值變化較大。

甚至是不同的實驗室測出來的都會有差異。亦可使用PCR法測定滴度，其引物設計針對病毒顆粒的通用cDNA區域，因此不受外源插入片段的影響，也不需要反轉錄步驟，而且可以用于所有慢病毒載體。

注意事項

1.避免使用小量抽提質粒，其純度相比中抽和大抽而來的質粒純度較低，可能會降低包裝效率。

2.對于基于HIV-1的慢病毒載體而言，依實驗目的，可能需要Vpr或者Rev輔助蛋白因子。有些細胞類型需要這些輔助蛋白的參與才能達到高侵染效率。

3.包裝細胞系的質量對高效包裝病毒非常關鍵。轉染時，細胞密度在40-60%之間比較合適，過低或者過高密度都可能會降低病毒包裝效率。細胞開始出現匯合時，需要及時更換或者添加新鮮培養基以保持細胞健康狀態。

4.氯喹對細胞有毒性，一般將標準使用濃度之下的氯喹與細胞共孵育的時間控制在8小時之內。或者降低氯喹的使用濃度，延長孵育時間。

5.病毒包裝時的細胞培養溫度需要綜合兩方面因素考慮：a)，370C最有利于保持細胞健康狀態;b)，320C最有利于維持重組病毒的穩定性。

6，收集病毒上清時的離心步驟可以去除細胞碎片以及少數懸浮的293T細胞。必要時，需要過濾以徹底去除一些細胞成分的污染。

7.凍融會降低病毒侵染效率50%，因此需要避免多次反復凍融。病毒放置于40C時每36-48小時侵染效率下降50%。

8.視實驗目的而定，為降低血清成分污染，建議使用低濃度血清培養基。

9.通過使用0.45mm的濾膜不僅可以去除細胞碎片殘留，還可以去除VSV-G殘留片段對細胞的毒性影響，但同時也會部分影響病毒滴度，所以過濾步驟需要依據具體實驗目的而定。

10.使用TNE重懸病毒沉淀時，雖然低體積會增加病毒濃度，然而由于VSV-G介導病毒與細胞的融合，所以高濃度VSV-G對細胞會造成一定毒性，而有些細胞對VSV-G引起的毒性比較敏感，因此最終體積需要依據具體實驗而定。

11.超離心純化病毒步驟可以重復二次，第二次可以使用培養基而不是TNE溶液重懸病毒。

12.使用病毒載體侵染細胞時，細胞密度對侵染效率有較大影響。細胞匯合密度過高會降低侵染效率。

13.侵染所使用的病毒載體體積和病毒滴度，病毒載體的質量以及靶細胞種類有關。

14.使用polybrene之后，需要更換新鮮培養基，因為polybrene對細胞有毒性作用。少數細胞會特別敏感，因此不同細胞polybrene的最佳作用濃度和時間都有所不一樣。

15.針對懸浮培養細胞的病毒載體侵染，建議使用Spin Infection方法，此法對于侵染效率低的貼壁細胞同樣有幫助。