慢病毒包裝實驗

質粒 293T細胞

無血清培養基 脂質體 胰酶 含血清的培養基 DMEM

EP管 6孔板 CO2培養箱 高速離心機 -80°C冰箱

以六孔板中的1孔為例，每個樣品需要1x10⁶個293T細胞。

1. 取1.5ml滅菌EP管，加入1.5ug包裝混合質粒和0.5ug表達質粒以及250ul的無血清培養基。輕柔混勻，室溫孵育5min。

2. 取1.5ml滅菌EP管，取9ul 脂質體2000l溶于250ul無血清培養基中。輕柔混勻，室溫孵育5min。

3. 將DNA溶液和脂質體溶液輕柔混勻。室溫孵育20min

4. 用胰酶消化并記數293T細胞。用含血清的培養基重懸細胞。

5. 在六孔板中每孔，加入1ml含血清的生長培養基，再加入DNA-脂質體復合物。

6. 將1ml重懸的293T細胞（1x10⁶個細胞/ml）加入到平板中。37℃ CO₂孵箱中孵育過夜。

7. 移除含有DNA-脂質體復合物的培養基移除，代之以DMEM（含丙酮酸鈉和非必須氨基酸）。

8. 轉染后48-72h收獲含病毒的上清。3000 rpm 離心20min，去除沉淀。

9. 病毒上清-80℃貯存。

包裝出來的慢病毒對NIH/3T3細胞達90%以上感染效率。

1．慢病毒理論上可以包裝5～7Kbp的片段，但過大的片段包裝會影響病毒的出毒效率，導致獲得的病毒滴度較低，影響病毒感染效果。因此一般建議最好將包裝的片段控制在1.5Kbp以內。

2．病毒載體易突變和丟失，克隆過程中可能出現質

粒的包裝信號突變或大小不等的片段丟失，導致無法成功包裝出病毒。因此建議構建好含有目的基因的克隆載體(尤其插入片段大于1.5Kbp)后首先進行測序，以確保關鍵序列都正確無誤。

3．包裝細胞多選擇為293T或293FT。要求細胞生長旺盛、狀態良好，避免過密生長和體外傳代次數過多。

4．轉染時對質粒純度要求較高，最好為去掉內毒素

的超螺旋質粒，以提高轉染效率。多采用磷酸鈣轉染方法，既節約成本又可獲得高的轉染效率(一般可達到80％～95％)。

5．無論是三質粒或四質粒慢病毒系統，轉染的各質

粒之間的比例非常重要，直接影響出毒效率。不同公司提供的質粒有所差別，因此無法一概而論，需要根據給出的比例進行調整優化。

6．轉染前，細胞密度控制在50％～60％為佳。轉染前4～8h換液，轉染后不換液。轉染第2天添加丁酸鈉(TPA)可明顯提高出毒率，之后8h再換液。每次換液前應將培養基預熱至37℃，換液時動作輕柔以防細胞漂起。

7. 一般情況下，轉染48h后收獲得到的病毒顆粒最多，但也與當時細胞狀態、生長速度和培養基pH值有關。收獲病毒時培養基應呈紅色，若過酸呈現黃色則會降低病毒收獲率。

8. 不同廠家和批次的血清對病毒的產量影響很大，

需要篩選。

9．病毒液避免反復凍融，否則明顯降低效率。

10．一般情況下，病毒液于-80℃中可保存1年，但建議半年之后重新檢測病毒滴度。

構建慢病毒載體的過程比較復雜，自己構建既費時又費錢，一般情況下委托生物公司代為構建比較好。目前國內已有公司提供慢病毒的包裝，研究人員只需將欲包裝的基因序列號或堿基序列提供給公司，即可在2～3個月內拿到純化好的3×10⁷—30×10⁷Tu的病毒顆粒，可直接用于細胞水平或動物體內實驗，所有費用約為1.8萬。

來源《腫瘤分子生物學與細胞生物學實驗手冊》，《細胞與分子生物學常用實驗技術》。