慢病毒載體研究

一、慢病毒

逆轉錄病毒（Retrovirus）：是一種RNA病毒，在復制時需在逆轉錄酶的作用下首先將RNA轉變為cDNA， 再在DNA復制、轉錄、翻譯等蛋白酶作用下擴增。主要包括RNA腫瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三種亞科。

慢病毒（Lentivirus）：屬于逆轉錄病毒科，名稱源自該種病毒長達數年的潛伏期。

最經典的慢病毒是由HIV病毒改造而來，而且HIV-1/HIV-2系統也得到了廣泛的應用，除了HIV病毒系統以外，后續還有猿類免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）載體系統、貓免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）載體系統、綿羊梅迪-維斯納病毒（MMV）載體系統和馬傳染性貧血(EIA）載體系統等。

慢病毒結構：

2個調節基因：

（1）tat基因：反式激活因子，對HIV基因起正調控作用。

（2）rev基因：病毒蛋白表達調節因子，增加gag和env基因對結構蛋白的表達。

4個輔助蛋白（附屬）基因：

（1）vif和vpu調節感染性病毒顆粒的產生；

（2）vpr和nef參與疾病的表現。

慢病毒的優勢：

1.慢病毒攜帶的基因組可整合到宿主基因組，使宿主細胞長時間穩定表達外源基因；

2.可感染分裂和非分裂細胞；

3.低免疫原性，直接注射活體組織不易造成免疫反應，適用于動物實驗；

4.可以更換特異性啟動子；

5.野生型的HIV大小約為9.8 kb，插入片段可長達5-6 kb；

二、慢病毒載體

慢病毒載體（Lentivirus）是一類改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒載體，是逆轉錄病毒的一種，基因組是RNA，其毒性基因已經被剔除并被外源性目的基因所取代，屬于假型病毒。可利用逆轉錄酶將外源基因整合到基因組中實現穩定表達，具有感染分裂期與非分裂期細胞的特性。

慢病毒包裝過程：

慢病毒基因組進入細胞后，在細胞漿中反轉錄為DNA，形成DNA整合前復合體，進入細胞核后，DNA整合到細胞基因組中。整合后的DNA轉錄成mRNA，回到細胞漿中，表達目的蛋白；或產生小RNA。慢病毒介導的基因表達或小RNA干擾作用持續且穩定，并隨細胞基因組的分裂而分裂。

慢病毒包裝和侵染細胞的過程（元和生物）

三、慢病毒的使用和優勢

慢病毒的使用量的取決因素：滴度， 感染體積 ，MOI ，細胞密度

滴度（Titer）：單位體積液體中有感染能力的病毒或噬菌體數目。單位：TU/mL （活性滴度單位）、copies/mL （物理滴度單位）

檢測方法：定量PCR檢測干擾后細胞基因組中外源DNA拷貝數。

實驗原理：慢病毒介導外源基因以逆轉錄方式整合進目的細胞基因組。

MOI（multiplicity of infection）：感染復數或者復感染指數。指感染時病毒和細胞數量的比值。在實驗中也將某個細胞達到 80%感染時所需的MOI 值定義為這個細胞的MOI值。加的病毒量(μl)=細胞數×MOI/滴度(…/ml) ×1000。

最后，818 一些有關慢病毒方面的產品：

1.關于慢病毒載體構建方面：

ORF表達克隆產品【LPP-貨號-載體-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】

shRNA克隆產品【LPP-貨號-載體-050，shRNA慢病毒】

miRNA克隆產品【LPP-貨號-載體-050，miRNA/inhibitor慢病毒】

Cas 9 和sgRNA克隆產品【LPP-CP-LvC9NU-載體-100，Cas9 慢病毒】

2.慢病毒包裝服務方面（慢病毒顆粒，病毒濃縮，包裝細胞系等）

LT001，基于HIV骨架的慢病毒顆粒包裝試劑 (20 reactions)

LT005，基于qRT-PCR技術的HIV骨架慢病毒顆粒滴度檢測試劑 （20次RT反應 +50次PCR反應）

LT007，慢病毒濃縮試劑盒（50 ml）

LT008，293Ta慢病毒顆粒包裝細胞系 (1.5 x 106 cells)