我學者用CRISPR讓豬生產人血白蛋白

　　在許多情況下，在大型家養動物中進行精確的基因組修飾，是可取的。在過去，這只能通過冗長而繁瑣的克隆程序才能進行。近期，來自軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所、第三軍醫大學、南京大學、國家蛋白質科學中心和廣州醫科大學附屬第一醫院的研究人員，通過使用最新的基因組編輯工具CRISPR/Cas9，將人血白蛋白cDNA敲入豬Alb基因位點，產生了重組人血清白蛋白（rHSA）。相關研究結果發表在最近的《Scientific Reports》。

　　國家“千人計劃”獲得者、北京蛋白質組研究中心副主任張普民教授和第三軍醫大學基礎部實驗動物學教研室主任魏泓教授，是本文共同通訊作者。南京大學模式動物研究中心的黃行許教授也是本文共同作者之一。

　　人血清白蛋白（HSA）是血漿中含量最豐富的蛋白質，在人體生理學中起著關鍵的調節作用，包括血漿膠體滲透壓的維護、調節體液分布、小分子運輸等等，是一些嚴重疾病（如肝功能衰竭和外傷性休克）的常規處方藥。由于人類血液供應不足以及與人類血液相關的風險，科學家們一直都在尋求人血清蛋白的替代生產。

　　之前，有科學家以Albumin-GFP融合的形式進行顯性轉基因表達，在豬中生產出了重組HSA。然而，在轉基因的方法當中，由于存在內源性的豬白蛋白，因此，rHSA的分離和純化都是有疑問的。

　　在這項研究中，研究人員利用CRISPR/Cas9系統在基因組修飾中的力量，通過將人血清白蛋白cDNA敲入豬的白蛋白基因位點，在豬當中生產重組人血清白蛋白。

　　通過將人ALB cDNA加SV40 polyA信號序列（總長2368bp），注入豬Alb位點下游起始密碼子，研究人員希望人類ALB能在豬內源性白蛋白基因的轉錄調控下表達，同時阻止豬內源性白蛋白的表達。研究人員設計了一個sgRNA靶定起始密碼子區域，并生成一段目標片段（同源重組的供體），在兩側插入1

　　kb的同源序列。

　　因為用于供體的5′同源序列達到了起始密碼子，它包含sgRNA序列，從而可以在同源重組后被sgRNA靶定作為供體或敲入基因。為了防止這種情況發生，研究人員在起始密碼子之前向sgRNA序列中插入了6

　　bp（gccacc）。sgRNA是在體外轉錄、純化，并連同Cas9 mRNA和包含靶片段的循環載體，一起注入受精卵。卵母細胞的來源是巴馬小型豬。在植入發情期的同步雌性豬之前，注射的胚胎被培養了1到2

　　小時。約300只胚胎被植入10名雌性豬體內，其中5只豬懷孕，并產下了16只活的幼崽。幼崽在標準的照顧下，并沒有出現任何不尋常健康問題的跡象。

　　經過基因型分析，研究人員發現，16只豬仔攜帶了預期的敲入基因，這些豬仔血液中存在人血清蛋白。此外，這個敲入的等位基因被成功地傳遞給后代。精密基因組工程的這一成功，有望促進科學家探索豬和其他大型家養動物，用以生產生物醫學產品，或選育具有更理想性狀的家畜品種。