掃描電子顯微鏡生物樣品制備技術詳細介紹（十七）

低溫制備方法

利用低溫技術處理樣品時，上述在室溫制樣過程中出現的許多問題都會大大減少。冷凍生物技術在生物樣品的X射線分析研究中越來越重要，它大概是人們可望分析可溶性離子和元素的唯一途徑。冷凍固定完全是個物理過程，能夠顯著地提高某些軟生物組織的機械強度，水從液體轉變為固體，抑制了生理過程，而且最大限度地減少可溶性物質的移動，因此，它大概是在接近自然狀態下保存生物組織的唯一方法。此外，樣品在低溫下分析，還具有另一些優點：污染速率明顯降低;樣品在電子束下損傷較少。所以，這是一種較理想的方法，它與與冷凍超薄切片技術大致相同，主要區別是一個著重考慮結構，另一個著重考慮元素分析。下面就這些區別作簡單討論。

固定：對樣品做任何形式的化學固定都能引起膜的滲透性發生顯著變化，從而引起元素的重新分布，因此，最好不作任何化學固定。如果為了保持結構而必須固定時，最好是進行對照研究，一半樣品經過固定，用于形態學研究，另一半不經固定，用于微區分析。

包埋:為了便于進行切片，需將樣品放在溶于生理親合液的惰性物質中包埋，當樣品被冷卻時，包埋劑又可增加樣品的機械強度，有利于切片。通常包埋劑有：瓊脂、牛血清蛋白、右旋糖酐、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和濃度為10%～30%的羥乙基淀粉(HES)等。

冷凍保護:在冷凍過程中，即使是極小的組織塊，實際上或多或少總會產生冰晶損傷的，使用冷凍保護劑滲透樣品，可大大減少冰晶損傷。研究表明：常用的穿透性冷凍保護劑如甘油和二甲基亞砜，雖然可以減小冰晶尺寸，能較好地保存結構，但卻會給細胞帶來嚴重的生理損傷，而且這些物質揮發性低，如果使用冷凍干燥技術，則難以將其去掉，因此，不適用于X射線分析。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和羥乙基淀粉(HES)能明顯地減少細胞中冰晶損傷，較好地保存結構，同時對組織的生理機能造成的干擾最小，而且它們又是較好的包埋劑，有利于切片，因此，是較好的冷凍保護劑。

冷凍方法:冷凍方法與冷凍技術一章討論的基本相同，稍要注意的是：大部分生物材料進行X射線微區分析時，最好使用液氮，液態一氟二氯甲烷(84k)或含有8%甲基環乙烷的異戊烷(100k)冷卻樣品。如果進行含氯元素X射線分析，最好不要用碳氟化合物，否則微量鹵族元素會留在冷凍樣品中，影響分析結果。此外，組織冷凍一旦完成，應立即放入液氮中貯存或盡量保持低溫以防止冰的再結晶。冷凍過程同樣會引起可溶性元素的位移，但程度較輕。因為細胞內結冰的過程需要有一定的時間，這過程會有水的液相與固相共存的狀態，此時，液體中電解質濃度顯著增加，使膜的兩側附近的電化學梯度發生變化，因而反過來又造成某些離子的重新分布。