生物樣品經過脫水、干燥處理后,其表面不帶電,導電性能也差。用掃描電鏡觀察時,當入射電子束打到樣品上,會在樣品表面產生電荷的積累,形成充電和放電效應,影響對圖象的觀察和拍照記錄。因此在觀察之前要進行導電處理,使樣品表面導電。常用的導電方法有以下幾種:
1) 金屬鍍膜法
金屬鍍膜法是采用特殊裝置將電阻率小的金屬,如金、鉑、鈀等蒸發后覆蓋在樣品表面的方法。樣品鍍以金屬膜后,不僅可以防止充電、放電效應,還可以減 少電子束對樣品的損傷作用,增加二次電子的產生率,獲得良好的圖象。
a.真空鍍膜法
真空鍍膜法是利用真空膜儀進行的。其原理是在高真空狀態下把所要噴鍍的金屬加熱,當加熱到熔點以上時,會蒸發成極細小的顆粒噴射到樣品上,在樣品表面形成一層金屬膜,使樣品導電。噴鍍用的金屬材料應選擇熔點低、化學性能穩定、在高溫下和鎢不起作用以及有高的二次電子產生率、膜本身沒有結構。現在一般選用金或金和碳。為了獲得細的顆粒,有用鉑或用金—鈀、鉑—鈀合金的。金屬膜的厚度一般為10nm~20nm。真空鍍膜法所形成的膜,金屬顆粒較粗,膜不夠均勻,操作較復雜并且費時,目前已經較少使用。
b.離子濺射鍍膜法
在低真空(0.1~0.01托)狀態下,在陽極與陰極兩個電極之間加上幾百至上千伏的直流電壓時,電極之間會產生輝光放電。在放電的過程中,氣體分子被電離成帶正電的陽離子和帶負電的電子,并在電場的作用下,陽離子被加速跑向陰極,而電子被加速跑向陽極。如果陰極用金屬作為電極(常稱靶極),那么在陽離子沖擊其表面時,就會將其表面的金屬粒子打出,這種現象稱為濺射。此時被濺射的金屬粒子是中性,即不受電場的作用,而靠重力作用下落。如果將樣品置于下面,被濺射的金屬粒子就會落到樣品表面,形
成一層金屬膜,用這種方法給樣品表面鍍膜,稱為離子濺射鍍膜法。
和真空鍍膜法比較,離子濺射鍍膜法具有以下優點:
(1)由于從陰極上飛濺出來的金屬粒子的方向是不一致的,因而金屬粒子能夠進入到樣品表面的縫隙和凹陷處,使樣品表面均勻地鍍上一層金屬膜,對于表面凹凸不平的樣品,也能形成很好的金屬膜,且顆粒較細。
(2)受輻射熱影響較小,對樣品的損傷小。
(3)消耗金屬少。
(4)所需真空度低,節省時間。
2) 組織導電法
用金屬鍍膜法使樣品表面導電,需要特殊的設備,操作比較復雜,同時對樣品有一定程度的損傷。為了克服這些不足,有人采用組織導電法(又稱導電染色法),即利用某些金屬溶液對生物樣品中的蛋白質?脂類和醣類等成分的結合作用,使樣品表面離子化或產生導電性能好的金屬鹽類化合物,從而提高樣品耐受電子束轟擊的能力和導電率。
此法的基本處理過程是將經過固定、清洗的樣品,用特殊的試劑處理后即可觀察。由于不經過金屬鍍膜,所以不僅能節省時間,而且可以提高分辨率,還具有堅韌組織,加強固定效果的作用。
組織導電法主要有碘化鉀導電染色法、碘化鉀--醋酸鉛導電法、丹寧酸—鋨酸導電法等。比較常用的是丹寧酸—鋨酸導電法,其具體操作方法如下:
a.樣品處理:按常規方法取材、清洗及用戊二醛固定。
b.導電染色:將樣品放入2%~4%丹寧酸溶液中浸泡。如果觀察表面結構,浸泡時間為30分鐘;如果觀察內部結構,浸泡時間為8小時,即可過夜。在浸泡過程中,可更換一次溶液。
c.清洗及再固定:用磷酸緩沖液充分清洗,然后放入1%鋨酸中固定2~4小時,再用磷酸緩沖液清洗。
d.脫水和干燥:按常規方法。
e.掃描電鏡觀察。