抗癌藥物對ⅡDNA拓撲異構酶作用的實驗

實驗方法原理 DNA拓撲異構酶在DNA形成環狀和超螺旋結構中起重要作用。另一方面在DNA超螺旋結構的松懈、DNA單、雙鏈的斷裂以至再連接的過程均有賴于該酶的參與，從而使DNA的復制或重組成為可能，關于抗癌藥如烴化劑和非烴化劑，其中許多是以DNA拓撲異構酶為靶點使之形成可斷裂的DNA蛋白復合物從而引起DNA損傷，這是近年來發展起來的一個新的研究領域。

實驗材料 DNA

試劑、試劑盒 二甲基亞砜HepesKClEDTAMgCl2ATPBSAP4DNA聚乙二醇NaCl

儀器、耗材 電泳儀吸收度計恒溫水浴鍋恒溫培養箱分光光度計離心機

實驗步驟

一、材料準備

1.  藥物制備

（1）將藥物溶解于0. mol/l Hepes緩沖液或含10%~20%的二甲基亞砜中或其它助溶劑中。

（2）其它80%~90%為0.1 mol/l Hepes緩沖液，pH6.7，使藥物的最終濃度為0.2~0.4 mmol/l。

2.  反應液

（1）反應液體積為24 ul

（2）其中包含500 mmol/l Hepes pH6.7，50 mmol/l KCl 100 mmol/l NaCl，0.1 mmol/l EDTA，10 mmol/l MgCl2，0.1 mmol/l ATP，50 ug/ml BSA，0.26ug P4DNA。

二、實驗步驟

1.  實驗將微量試管分組為

（1）加藥管、不加藥對照管，已知藥（VP-16）對照管和標準管（含不同濃度的酶，根據所用酶的活性定出第一管的酶稀釋度，然后依次成倍遞減至第四管，第5管不含酶的空白管）。

（2）除空白對照管外將其與全部管中均加入酶液（濃度同標準管第一管的濃度）。

（3）放恒溫水浴30 min 即刻用終止液停止反應（終止液：2%sodium dodecyl、20%甘油。0.05%溴酚藍）。

2.  將以上各管的樣本加到1%瓊脂糖凝膠上在電泳緩沖液（90 mmol/l tris-boric acid pH8.3和2.5 mmol/l EDTA）中進行電泳，50V過夜。

3.  電泳終了將凝膠膜用溴乙啶染色（30~40 min），此時用紫外燈照射則DNA可顯示熒光帶。

4.  然后可用吸收度計進行定量測定或用熒光帶的長度與個標準管進行對比，亦可獲得半定量的結果。

5.  一個酶單位是指在30 min內可使50% 0.26ug超螺旋DNA轉變為解旋轉的DNA，每個測定是用兩個酶單位。

6.  Ⅱ型DNA拓撲異構酶的分離制備

（1）人的Ⅱ型酶可用從白血病患者獲得，例如慢性淋巴細胞白血病患者的外周白血病細胞中分離。

（2）將分離出的酶再用聚乙二醇純化，再通過羥基磷灰石柱色譜、肝素-瓊脂糖柱色譜和六氨基瓊脂糖親和色譜，使之純化。

（3）用Coomassie藍進行染色可見142 000、132 000和114 000 dalton三個區帶。

7.  P4超螺旋DNA的制備