擬南芥突變體純合植株的獲得

實驗概要

本實驗利用農桿菌轉化侵染野生型擬南芥獲得變體純合植株。

實驗材料

擬南芥(Arabidopsis thaliana, Col-0)，培養條件，長日照為16h光照/8h黑暗，22^oC；短日照為8h光照/16h黑暗，22^oC。

實驗步驟

1. 擬南芥基因組的小量提取

    1) 取0.2 g擬南芥葉片，于液氮中研磨成粉；

    2) 轉入1.5 mL離心管中，加入800 uL 2XCTAB提取緩沖液，充分混勻，65^oC保溫30 min，其間不時搖動；

    3) 加入200uL氯仿，輕輕顛倒離心管混勻，室溫下12000 rpm，離心l 0 min；

    4) 取上清，轉入新的1.5 mL離心管中，加入200 uL氯仿，輕輕顛倒離心管混勻，室溫下12000 rpm，離心l 0 min；

    5) 將上相轉入另一新1.5 mL離心管中，加2倍體積無水乙醇，1/10體積3 mo1/L NaAC C pH 5.2混勻，-20^oC沉淀20 min；

    6) 12000 rpm離心，棄去上清，干燥沉淀；

    7) 30 uL TE回溶。

2. 載體構建

    1) PCR擴增

PCR擴增體系為25uL，具體成分如下。

反應步驟為：預變性94^oC 5min

循環條件：94^oC 30s，50-60^oC 30s，72^oC 1-2min；循環30次，

后延伸：72^oC l0min。

反應結束后，進行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測是否有目的條帶，進行下一步試驗。

    2) 連接反應

連接載體為pGEM-T Easy和pMD 18-T載體，插入片段與載體的摩爾數比為2-10:1兩種載體的連接反應體系分別見表A和B。

混勻，16 ^oC連接3h以上，然后轉化大腸桿菌。

    3) 酶切

酶切反應體系如下表所示。加樣后于37^oC放置2-4h，電泳觀察酶切片段的位置和大小，以判斷酶切情況。

    4) 凝膠電泳中DNA片段的回收

用Biometra試劑盒，具體步驟如下：

        a. 用干凈刀片切下含有目的DNA片段的瓊脂膠塊，放入1.5 mL離心管中；

        b. 按400uL/100mg瓊脂糖凝膠比例Binding Buffer，置于50-60 ^oC水浴l0min，至膠完全融化，期間每隔2min搖動一次；

        c. 將融化的膠溶液轉移到含有2mL收集管的UNIQ-10柱中，室溫放置2min；

        d. 室溫，12000rpm，離心lmin；

        e. 12000rpm，取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一個收集管中室溫離心lmin；

        f. 將UNIQ-10柱放入一個新的1.5 mL的離心管中，在柱子膜中央加入70^oC預熱的水，室溫或37^oC放置2min；

        g. 12000rpm，室溫離心1 min，離心管中的液體即為回收的DNA片段，可立即使用或存于-20^oC備用。

    5) 超表達載體的構建

利用AtHELPS和AtRDEM的擴增全長引物分別克隆得到基因片段，連接到克隆載體pMD18-T Simple；鑒定其陽性克隆，測序，提取質粒DNA，雙酶切后連接到載體pBI121中替換GUS報告基因，再次連接轉化篩選后進行農桿菌轉化侵染野生型擬南芥。

    6) 啟動子驅動GUS報告基因表達載體的構建

利用AtHELPS和AtRDEM的啟動子引物分別擴增出它們的啟動子序列，連接到pMD18-T Simple載體。經測序確定序列無誤后，經酶切，連接等一系列步驟，用所研究的基因啟動子替換含有GUS報告基因的表達載體中的35S啟動子。

3. PCR鑒定突變體純合植株

將擬南芥種子用70%乙醇消毒5min和2.6%次氯酸鈉消毒l0min后，用0.02%的吐溫水清洗4-5遍，將種子平鋪于GM培養基上。4^oC培養3d，移到培養室中長口照培養5d后把生長正常的幼苗移置營養土中。然后取4w后的葉片提取基因組DNA, PCR進一步簽定。其原理如下圖所示:

LP, RP分別為基因的左邊界和右邊界，LBbI為T-DNA上的序列。用二條引物進行PCR擴增，結果如右圖所示。用LP和RP擴不出條帶，而用RP和LBb 1能擴出條帶的為突變體純合株。