拯救漸凍人，發現ALS真正誘因

　　肌萎縮性脊髓側索硬化癥(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)，又被稱作盧伽雷氏癥，也就是最近被大家所關注的漸凍人。該疾病是由于破壞性的神經退行性變和運動神經元缺失所引起，病人肌肉麻痹，一般在發病后2到5年內就會死亡。目前，這種疾病仍然無藥可治。

　　ALS與其他神經退行性變疾病的遺傳型和表型有一定的相似性，比如額顳癡呆(frontotemporal dementia，FTD)，這種疾病會影響人的性格和語言能力。Mizielinska等研究者發現，在人的9號染色體第72個開放閱讀框 (C9orf72)上所出現的基因突變是造成ALS和FTD的最常見原因。該突變主要表現為，一個位于C9orf72基因的非編碼區域內的六核苷酸重復序列GGGGCC，出現非正常大量擴增。通常情況下，重復序列拷貝數從2到23個不等，但是在ALS和FTD病人體內，這個重復序列拷貝數達到了上百個甚至上千個之巨。研究者認為正是這些重復，組成了致病區域，并開始對突變的致病機制及后續的治療策略進行深入的研究。

　　關于這些GGGGCC重復序列的致病原理，目前主要有三類假說。第一類認為，如此多的重復序列可能會干擾C9orf72基因的表達，產生不利影響。第二類假說認為，GGGGCC序列的轉錄本(同時還有GGGGCC序列反義鏈轉錄本)可能會在某些RNA位點聚集，阻斷RNA結合蛋白，破壞RNA功能。最后一類假說認為，在RNA的六個閱讀框中的重復序列(正義鏈和反義鏈)都會被翻譯進入蛋白，且不依賴于起始密碼子ATG。這種與重復序列RNA翻譯過程會產生數類二肽重復區域，包括甘氨酸-丙氨酸(glycine-alanine , GA)、甘氨酸-脯氨酸(glycine-proline, GP)、脯氨酸-丙氨酸(proline-alanine, PA)、甘氨酸-精氨酸(glycine-arginine, GR)和脯氨酸-精氨酸(proline-arginine, PR)。二肽多聚蛋白很容易自我聚集，并在腦部區域富集。當然，這三個假說機制并不互相排斥，但是每類假說的角色，對于開發藥物非常重要。

　　為了確認這些重復RNA序列和二肽的致病性，Mizielinska等人重構了一類重復序列RNA重組子，他們每隔12個重復就在RNA的正義鏈和反義鏈上都構建一個終止子。理論上講，用這種方法構建的重組子可以正常轉錄RNA，但是無法翻譯二肽多聚蛋白。但是Mizielinska等人發現，正常的重復序列和構建的重復序列都會形成GGGGCC重復序列特有的G-四聯體產物，這表明這種構建策略不會影響重復結構，野生的和構建的重組子依然會結合到神經細胞的RNA上。研究者接下來又對果蠅進行了轉基因改造，使其表達野生的或重構的重復序列。結果發現，在果蠅眼部，野生型重復序列會造成RNA降解，但是重構的重組子不會產生這樣的效果。在成年果蠅的神經系統內表達野生型重復序列會引起中毒反應，但是重構的重組子沒有效果。使用放線菌酮阻斷果蠅RNA翻譯會部分抑制野生型重復序列的作用，表明它所引起的中毒反應與翻譯有關。Mizielinska等人認為，GGGGCC重復序列不是通過RNA，而是通過其大量的翻譯產物引發了中毒反應。

　　為了確認C9orf72重復序列所產生的五種二肽中，哪一個才是引起神經退行性變的真兇，Mizielinska等人又為每種二肽單獨構建了轉基因果蠅。因為密碼子簡并性，他們不是用GGGGCC序列翻譯二肽，而是使用無重復序列密碼子。五種二肽中，GR和PR會在果蠅眼部及神經系統中引起中毒反應及其他不良癥狀，其他的不會有毒性，但是GA二肽在更年長果蠅中會產生毒性。

　　Kwon 等人同樣發現GR和PR會引起中毒反應，但是他們提出了一個新的假說來解釋GR和PR與FTD和ALS發病機理的聯系。他們從更廣泛的角度研究了ALS和 FTD兩個最令人激動的新理論之間的聯系：C9orf72核苷酸重復序列的非正常擴增和RNA結合蛋白富集低復雜度序列(如二肽多聚蛋白)形成復合體，進入水凝膠內。這些蛋白很多都含有絲氨酸-精氨酸多聚區域，通過對該區域絲氨酸殘基的磷酸化調控，可以控制其與水凝膠的結合。絲氨酸殘基被磷酸化時，SR多聚蛋白從水凝膠釋放。SR多聚蛋白上多數突變都是絲氨酸突變為甘氨酸，從而阻止磷酸激酶的作用，突變的SR多聚蛋白將無法再從水凝膠中被釋放。

　　Kwon 發現，一些C9orf72重復序列產生的二肽產物類似于突變的SR域(比如GR和PR)，于是他們提出一個有趣的假設：這些產物與水凝膠結合，但是不受磷酸激酶的調控，它們可以阻塞一些含有SR多聚區域的RNA結合蛋白在細胞內傳輸信息。這種對信息流動的阻礙會引起細胞功能紊亂，在ALS和FTD發病過程中可能加劇神經退行性變。實驗結果證明，GR或PR兩類二肽產物會結合到hnRNPA2水凝膠，對磷酸激酶有抗性(就像突變的SR域)。當Kwon將這些 GR和PR蛋白加入野生細胞，它們會進入細胞核，引起細胞死亡。

　　為了確定GR和PR在核內定位及它們引起中毒反應的原因，Kwon把PR加入到培養的星形膠質細胞(ALS關鍵細胞)里，并進行了RNA測序。它們鑒定出大量可變剪切、mRNA表達量變化及大量核糖體RNA(rRNA)損傷。這些結果表明，C9orf72重復的二肽產物進入核仁，阻礙多種RNA生物進程，誘發疾病。Kwon等人假設，GR和PR二肽多聚產物的精氨酸富集區域模仿核定位信號，促進他們進入核內，對RNA生物合成進行破壞。起初，RNA合成通路的損傷可能較小，但隨著時間流逝，這種損傷也會不斷累積，并最終發展為神經退行性變。

　　Mizielinska等和Kwon等人的研究充分證明二肽毒性是造成神經退行性變的主要誘因。目前最大的挑戰是，解釋二肽多聚產物所造成神經中毒的機制及確定致病二肽產物。另一位研究者Su等人在其近期研究中從病人腦脊液中檢測和分析二肽產物，通過這種方法，對疾病相關二肽進行分析，在臨床實驗中可以用于評估靶向非正常重復RNA序列治療手段的效果。

　　對二肽產物分子機制的研究，可以催生ALS和FTD等疾病新的治療策略，會有更多的方法用于特異性阻止致病二肽產物產生，或者將其轉化為無毒替代物。或許在不遠的未來，漸凍人將不再無藥可救。

　　相關文獻：

　　West J P, Gitler A D. Clogging information flow in ALS[J]. Science, 2014, 345(6201): 1118-1119.

　　Kwon I, Xiang S, Kato M, et al. Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells[J]. Science, 2014, 345(6201): 1139-1145.

　　Mizielinska S, Gr?nke S, Niccoli T, et al. C9orf72 repeat expansions cause neurodegeneration in Drosophila through arginine-rich proteins[J]. Science, 2014, 345(6201): 1192-1194.