放射自顯影和從測序凝膠上讀取DNA序列實驗

實驗步驟

材料

緩沖液和溶液

貯存液、緩沖液和試劑的配方見附錄 1。
將貯存液稀釋到合適的濃度。

凝膠固定液

300 ml 甲醇
2.4L 水
300 ml 冰醋酸

放射性混合物

放射性墨水或化學發光標記物
參見附錄 9。
可重復使用的放射性墨水主要是選擇 Stratagene 的冷光標記物（Glosos)。標記物能被多次運用而且應該恰拾在一個新的放射自顯影循環之前被暴露在熒光燈下。

凝膠

DNA 測序膠
準備和電泳見方案 8~11。

特殊設備

放射自顯影暗盒（金屬，彈簧 35.6 cmX43.2 cm)

放射增感屏
每個膠片需要兩個大的增強的鎢酸鈣屏幕（例如，LighteningPlus,Dupont)。

80°C 的凝膠干燥機
凝膠干燥機應該被連接在一個真空系統上。

聚脂薄膜片（在長和寬上比凝膠大約 5 cm)
聚脂薄膜是為了保證凝膠在真空條件下干燥時保持平整。

絲龍（Saran) 巾

不銹鋼的金屬小鏟或手術刀

固定凝膠的托盤
托盤應該在長和寬上比凝膠大約 5 cm

Whatman3 MM CHR 濾紙（或等同的）

Whatman3 MM 濾紙（或等同的）

X 射線膠片（藍光敏感型 35 cmX43 cm）
對 ³²P 標記的 DNA 用雙層膠片如 X-Omat-AR(Kodak) 或 BioMaxMS(Kodak)。對 ³²P 和 ³⁵S 標記的DNA 用單層膠片如 BioMaxMR(Kodak)。

X 射線膠片處理器

方法

1. 在電泳結束后，關閉電源并使測序裝置和電源之間不再連接。棄去電源緩沖液，從裝置上取下膠模。

2. 將膠模平放在帶有塑料的保護性實驗室布上，使較小的（帶槽的）板位于最上方。
在操作前使凝膠冷卻到 37°C 以下。

3. 除去所有剩余的凝膠密封帶，用刮勺的一頭去慢慢地輕輕地撬開膠模的玻璃板。凝膠應該貼在較長的 (無槽的) 玻璃板上。

警告：要帶好安全眼鏡, 因為在這個步驟中玻璃板有時會破碎。同時，玻璃板的表面和凝膠接觸后可能會粘有放射性物質，應該妥善對待。



如果測序反應的產物是用 ³²P 標記的話步驟 4~13 可以省略。例如，酶法測序是用由 ³²P 標記的引物引發的或 [a-³²P]dNTP 在一個未標記的引物延伸時合并進去。當用袖珍監測器去掃描凝膠表面時，20~100cps 的閱讀量表示有足夠的放射性材料用于染色。在這種情況下，用 Saran 包裝膜蓋上凝膠，確保其上沒有褶皺。標記方向，直接將凝膠向 X 射線膠片暴露。此過程可能會出現放射性液體的泄漏，所以需離凝膠遠一些，不要為了節省幾小時的工作而冒險。
Maxam-Gilbert 測序反應中標記產物的放射活性通常不足以進行固定和染色。

4. 當玻瑰板分開后，將凝膠上先加樣一側的底角或頂角切去，以便在后續操作中確定凝膠的方向。

5. 將凝膠固定到凝膠固定液中（甲醇/乙酸；見材料）

含有 33P 或 35S 的測序凝膠在干燥以前應該先固定。這步是供用 32P 中標記的凝膠選擇的。固定提髙了分辨率。有時候加強了部分放射性信號的強度，并且減少了尿素或來自凝膠的甲酰胺的過髙濃度。固定也是移開凝膠的最后一個手段，因為凝膠很可能粘在膠模的兩塊板上。

6. 把凝膠（連同它的支持玻璃板一起）轉移到含有甲醇：乙酸溶液的淺盤中。在室溫下固定凝膠 30 min。固定期間不要攪動液體。
越薄的凝膠固定越快，越厚的凝膠越慢。一個 0.2 mm 厚的凝膠要固定 lOmin, 而 0.6 mm 厚的就需要 1b。
—批固定液能被用來固定幾塊凝膠。如果凝膠出現從支持玻璃板上脫落的征兆，可用硬塑料網（許多五金商店有售）蓋住以防滑掉或皺成一團。

7.30 min 以后，從固定液中非常非常慢地抬起玻璃板。在玻璃板上的大部分固定液排出之前要盡量保持板水平。把玻璃板放在一打紙中上，有凝膠一側在上。用 Kimwipes 紙擦去玻璃板上所剩的固定液。注意不要讓 Kimwipes 紙與凝膠表面接觸。
然后戴手套把凝膠上的褶皺和破損的地方輕柔地除去。

8. 準備一張 Whatman3 MMCHR 濾紙（或同等的），濾紙的長與寬均比凝膠略大一些(2~3 cm), 使濾紙保持弓形，把弓形濾紙的中心和凝膠的中心接觸。讓濾紙輕輕的落在凝膠的表面，然后輕輕壓一下使凝膠與濾紙的粗糙面牢牢相貼。

9. 一手將濾紙扶住，另一手將支持玻璃板提起，迅速將其翻轉，放在實驗臺上玻璃板向上。把玻璃板輕輕地向上提使 Whatman3 MMCHR 濾紙從玻璃板上分離下來。當玻璃板完全移開時，凝膠將與濾紙相貼。

10. 將 Whatman3 MMCHK 濾紙（凝膠朝上）放在兩張 Whatman3 MM 濾紙上，剪一張略大且寬于凝膠的 Swan 包裝膜放在凝膠之上。盡量避免折痕和氣泡的出現。這一步如在另一個人的幫助下會更容易完成。拿住 Sarari 包裝膜的角向外拉以使之繃緊伸展。將展平的 Saran 包裝膜放置到凝膠上面。一旦 Saran 包裝膜與凝膠接觸，就不要再試圖掀起它，因為這能使凝膠被撕裂。瓊脂糖凝膠梳的扁平末端、Kimwipess 紙或一張塑料卡都能把凝膠和包裝膜之間的氣泡趕走。
之所以這么選擇是因為放一張合適的 Saran 包裝膜在實驗臺上能確保不出現褶皺，然后可將凝膠顛倒使凝膠面向下朝向 Saran 包裝膜。

11. 用切紙刀或一把剪刀將所有 3 張 Whatman 濾紙和 Saran 包裝膜修剪使之與凝膠大小相同。

12. 將由濾紙、凝膠和 Saran 包裝膜組成的夾層放到凝膠干燥機中。包裝膜在最上面，在干燥期間用一片聚脂薄膜來保持夾層的平整。

13. 根據干燥機生產商的說明，在真空下 80°C 干燥凝膠 30~60 min。
干燥凝膠縮短了放射性粒子命中 X 射線膠片的距離，因此增加了探測的敏感度。

14. 從干燥機中取出凝膠，剝去 Saran 包裝膜。干燥過的凝膠應該摸上去很光滑而不黏。如果發黏，一個補救的方法就是把乳膠手套翻過來使有滑石粉的內側向外，用手套內側的滑石粉去拂凝膠表面。為了確定凝膠的方向，應在切去凝膠底角（步驟 4) 后 3 MMCHR 濾紙上形成的空缺處貼上一個用放射性的或化學熒光墨水做標記的黏性小標簽。

15. 在暗室里，把干燥的凝膠放進一個彈簧金屬箱里。用一片未曝光的 X 射線膠片覆蓋，關上暗盒。在室溫或-80°C 進行 16~24 h 的放射自顯影。
一塊測序膠所要求的最佳曝光時間難以精確預測。在測序反應期間如果每件亊都很好的進行的話，由于 5 或更多的因素。16~24 h 也許長了點。在不太好的情況下，通常要求曝光時間長一些。在這點上的主要目的是著著測序反應是否進行的很好和看帶的強度決定建立一個或更多的顫外曝光。

16. 按照膠片生產商的要求將放射自顯影片顯影，按下面讀取 DNA 序列所述。

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